細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株的分子質(zhì)量控制

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株的分子質(zhì)量控制

細(xì)菌反復(fù)突變?cè)囼?yàn)（也稱為ames試驗(yàn)）于1975年建立并不斷發(fā)展。以營(yíng)養(yǎng)缺陷的突變體為指示生物檢測(cè)突變體的外科臨試的常用菌株。這種普通菌株包括重組性氨基小鼠、傷寒沙病菌或氨基丙烯酸-脫希爾菌。因Ames試驗(yàn)檢測(cè)使用的均為突變型菌株,某些特性易丟失或變異,故Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株需進(jìn)行生物學(xué)特性(組氨酸缺陷、脂多糖屏蔽缺損、氨芐青霉素抗性、紫外線敏感性、四環(huán)素抗性、自發(fā)突變及回變特征)的質(zhì)量控制(質(zhì)控)以確保菌株的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性近年來,分子生物學(xué)技術(shù)已逐漸在標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定中得到應(yīng)用。研究中使用7株Ames試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株,并使用5種不同的分子生物學(xué)方法(16SrDNA、種屬特異性鑒定PCR、組氨酸操縱子關(guān)鍵突變位點(diǎn)序列分析、凝膠電泳和多位點(diǎn)序列分析方法)進(jìn)行質(zhì)控,并與傳統(tǒng)生物學(xué)特性的質(zhì)控方法進(jìn)行比對(duì),建立更加全面檢測(cè)Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株遺傳穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的方法。1材料和方法1.1菌株信息的獲得7株Ames試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株(組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌)及其突變?cè)季闘T-2均來源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(nationalcenterformedicalculturecollections,CMCC),突變?cè)季闘T-2在研究中可作為對(duì)照菌株,不具有進(jìn)行Ames試驗(yàn)的特性,其余Ames試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株的詳細(xì)信息見表1。1.2引物的合成DNA提取試劑盒QIAGENDNeasyBlood&TissueKit購(gòu)自QIAGEN公司;相關(guān)引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成,序列測(cè)定由生工生物工程(上海)股份有限公司(以下簡(jiǎn)稱上海生工)完成;PCR擴(kuò)增試劑盒PremixExTaq試劑盒、PrimeSTAR1.3微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法根據(jù)《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB15193.4-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》、《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21768-2008化學(xué)品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法》和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)》的規(guī)定1.3.1氨基丙烯酸的異質(zhì)結(jié)將過夜培養(yǎng)的增菌液分別于含組氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸平板上劃線,于37℃下培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。1.3.2營(yíng)養(yǎng)瓊物理帶的檢測(cè)吸取過夜培養(yǎng)的增菌液0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線,然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置,37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。1.3.3氨基丙烯酸抗劑吸取過夜培養(yǎng)的增菌液0.1mL,在氨芐青霉素平板上劃線,37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。1.3.4紫外照射試驗(yàn)吸取過夜培養(yǎng)的增菌液0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線,用錫紙(或黑紙)蓋住平板的一半,置紫外燈下照射(15W,距離33cm)8s,置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。1.3.5四環(huán)素抗劑吸取過夜培養(yǎng)的增菌液0.1mL于氨芐青霉素或四環(huán)素平板上劃線,置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。1.3.6底層培養(yǎng)基培養(yǎng)將過夜培養(yǎng)的增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi),混勻后鋪到底層瓊脂平板上,待瓊脂固化后,置37℃培養(yǎng)箱中孵育48h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。每個(gè)菌株做3個(gè)平行測(cè)定。1.3.7受試物的制備將含組氨酸-生物素溶液(0.5mmol/L)的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中,45℃水浴中保溫,然后每管依次加入試驗(yàn)菌株過夜培養(yǎng)的增菌液0.1mL和受試物(受試物名稱和終濃度見表1,充分混勻,迅速傾入底層瓊脂平板上,轉(zhuǎn)動(dòng)平板,使之分布均勻。水平放置待冷凝后,倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。試驗(yàn)中,還應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(即自發(fā)回變),每個(gè)菌株做3個(gè)平行測(cè)定。1.4分子物質(zhì)控制方法1.4.1pcr擴(kuò)增條件分別取菌株過夜培養(yǎng)物1.5mL,用QIAGENDNeasyBlood&TissueKit提取DNA。16SrDNA擴(kuò)增引物見表2。使用PremixExTaq試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95℃5min;95℃30s,55℃30s,72℃90s,共30個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和膠回收后送上海生工雙向測(cè)序,拼接后將序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)(/Blast.cgi)。1.4.2pcr擴(kuò)增條件使用1.4.1提取的DNA模板進(jìn)行下列試驗(yàn),用PremixExTaq試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,invA基因PCR反應(yīng)條件為:94℃5min;94℃1min,53℃2min,72℃30s,共30個(gè)循環(huán);72℃7min。mdh基因PCR反應(yīng)條件為:94℃3min;94℃30s,67℃30s,72℃30s,共30個(gè)循環(huán);72℃5min。種屬特異性鑒定PCR引物序列及產(chǎn)物大小見表3。1.4.3pcr擴(kuò)增條件根據(jù)文獻(xiàn)[11-13],7株標(biāo)準(zhǔn)菌株組氨酸操縱子突變位點(diǎn)分別位于hisC、hisD、hisG基因,針對(duì)這3個(gè)基因關(guān)鍵突變位點(diǎn)序列位置,設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,序列和反應(yīng)條件見表4。由于7株標(biāo)準(zhǔn)菌株均是由鼠傷寒沙門菌LT-2突變構(gòu)建而來1.4.4broandunup/brea重點(diǎn)菌株參照美國(guó)CDCPulseNet的統(tǒng)一PFGE方法,凝膠電泳分型所用標(biāo)準(zhǔn)菌株為SalmonellaBraenderup全球參考菌株H9812。運(yùn)用XbaI限制性內(nèi)切酶對(duì)LT-2株及7株Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行酶切電泳,PFGE圖像應(yīng)用BioNumerics數(shù)據(jù)庫(kù)軟件(AppliedMaths,Belgium)進(jìn)行處理,識(shí)別圖像條帶,并進(jìn)行聚類分析。1.4.5pcr擴(kuò)增對(duì)8株菌株的7個(gè)管家基因(thrA,purE,sucA,hisD,aroC,hemD,dnaN)進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見表5,由上海生工合成。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min;95℃變性1min,55℃30s,72℃1min循環(huán)30次;72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序,并通過與沙門菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica/documents/primersEnterica_html),獲得每個(gè)菌株的基因型和ST型。2結(jié)果2.1組氨酸、脂多糖屏蔽缺損、回復(fù)突變及回復(fù)突變特征結(jié)果顯示,7株標(biāo)準(zhǔn)菌株的生物學(xué)特性(組氨酸缺陷、脂多糖屏蔽缺損、氨芐青霉素抗性、紫外線敏感性、四環(huán)素抗性、自發(fā)突變及回變特征)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求,見表6。2.2酶法2.2.1雙向測(cè)序后拼接結(jié)果顯示,7株標(biāo)準(zhǔn)菌株均有特異性擴(kuò)增條帶,且質(zhì)量滿足測(cè)序要求,直接送上海生工進(jìn)行測(cè)序。雙向測(cè)序后,進(jìn)行拼接。將序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比對(duì),結(jié)果顯示均為沙門菌屬,見表7。2.2.2所選異質(zhì)分子診斷結(jié)果顯示,7株標(biāo)準(zhǔn)菌株均有特異性擴(kuò)增條帶,invA基因和mdh基因均為陽(yáng)性,判斷全部菌株均為鼠傷寒沙門菌,見圖1~2所示。2.2.3組氨酸作用縱子關(guān)鍵突變點(diǎn)的序列分析結(jié)果顯示,7株標(biāo)準(zhǔn)菌株在組氨酸操縱子區(qū)均有原始構(gòu)建的突變位點(diǎn),具有能夠進(jìn)行Ames試驗(yàn)的遺傳特征基礎(chǔ),見表8。2.2.4突變前后l結(jié)果顯示,8株菌株的帶型均不一致,分成了8個(gè)不同的帶型,最低的相似度為82%,相似度最高的兩株菌為CMCC50944和CM-CC50946,達(dá)到了97%,與突變?cè)季闘T-2相似度最高的是CMCC50945,為94%,見圖3。2.2.5菌株基因型和st型的鑒定結(jié)果顯示,除CMCC50943和CMCC50948外,其余6株菌株的7個(gè)基因型和ST型均一致,都是ST19型。CMCC50943和CM-CC50948與其余6株菌的差別在于hisD基因型為820,故這兩株菌的ST型為ST3438,見表9。3ames試驗(yàn)菌株的基因組氨和遺傳背景特性使用細(xì)菌對(duì)化合物進(jìn)行致突變性檢測(cè),是一種簡(jiǎn)單、靈敏、經(jīng)濟(jì)、快速的初篩方法。由于大部分的DNA損傷都會(huì)由切除重組修復(fù)系統(tǒng)修復(fù),因此,只有很少比例的可能性出現(xiàn)潛在的突變。Ames教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了一系列切除修復(fù)系統(tǒng)缺失的菌株,提高了菌株10~100倍的靈敏度,可以用于檢測(cè)移碼突變、堿基置換等突變Ames試驗(yàn)的關(guān)鍵是Ames試驗(yàn)菌株,這些菌株均由鼠傷寒沙門菌LT-2構(gòu)建而來在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行傳統(tǒng)的生物學(xué)特性鑒定后,利用分子生物學(xué)技術(shù),進(jìn)行了一系列的分子質(zhì)控方法的研究。16SrDNA、種屬特異性分子診斷能夠從分子水平保證試驗(yàn)菌株的屬性不變,結(jié)果顯示,7株標(biāo)準(zhǔn)菌株均為鼠傷寒沙門菌。組氨酸操縱子關(guān)鍵突變位點(diǎn)序列分析,是對(duì)菌株原始突變位點(diǎn)的分析確定。CMCC(B)50942、CMCC(B)50943、CMCC(B)50947和CMCC(B)50948突變類型為堿基的增加或減少,用于評(píng)價(jià)受試物導(dǎo)致移碼突變的能力;CM-CC(B)50944、CMCC(B)50945和CMCC(B)50946突變類型為單堿基的置換,用于評(píng)價(jià)受試物導(dǎo)致堿基置換的能力。這些突變位點(diǎn)的存在,即為Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株評(píng)價(jià)化合物致突變性的關(guān)鍵。同時(shí),標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范中的自發(fā)回變菌落數(shù)和陽(yáng)性對(duì)照菌落數(shù)均是在這些菌株具有這些突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)上測(cè)試得來的。如果試驗(yàn)菌株的突變位點(diǎn)發(fā)生變化,菌株的靈敏度可能會(huì)發(fā)生改變,即無法進(jìn)行有效的致突變性評(píng)價(jià)?，F(xiàn)階段的技術(shù)水平已經(jīng)很容易實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)鍵突變位點(diǎn)序列進(jìn)行分析,因此,增加組氨酸操縱子關(guān)鍵突變位點(diǎn)的序列質(zhì)控,是保證試驗(yàn)菌株關(guān)鍵特性的重要基礎(chǔ)。研究中還使用了分子流行病學(xué)常用的技術(shù)手段PFGE和MLST,對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行遺傳背景分析研究。MLST顯示了菌株部分管家基因的穩(wěn)定性,PF-GE的結(jié)果顯示了菌株遺傳背景的多樣性,雖然7株標(biāo)準(zhǔn)菌株均是從LT-2菌株誘導(dǎo)而來,但是PFGE的圖譜相似度并不高,沒有完全一致的帶型,說明在化合物誘導(dǎo)過程中,某些部位堿基的突變影響了酶切位點(diǎn),從而造成