葡萄糖和游離脂肪酸聯(lián)合作用對(duì)胰島細(xì)胞功能與凋亡的影響

葡萄糖和游離脂肪酸聯(lián)合作用對(duì)胰島細(xì)胞功能與凋亡的影響

近年來，肥胖和糖尿病已成為日益嚴(yán)重的健康問題。伴有肥胖和糖尿病的登峰糖尿?。╧sd）患者已開始關(guān)注臨床醫(yī)生和研究人員。這類患者起病時(shí)以高血糖和高游離脂肪酸(FFA)血癥為突出特征,同時(shí),這類患者還存在嚴(yán)重外周胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙1對(duì)象和方法1.1正常血糖高胰島素鉗夾試驗(yàn)4周齡雄性Wistar大鼠(n=55),其中5只為正常對(duì)照組(NC組),采用普通飼料〔碳水化合物57.83%,脂肪12.1%,蛋白質(zhì)30.07%,(產(chǎn)能比)總熱量415kcal/100g,1kcal=4.2kJ〕喂養(yǎng),另50只采用高脂飼料〔碳水化合物15.48%、脂肪62.31%、蛋白質(zhì)18.08%,(產(chǎn)能比)總熱量625kcar/100g〕喂養(yǎng)造模,造模組喂養(yǎng)12周后隨機(jī)取5只,行正常血糖高胰島素鉗夾技術(shù)評(píng)價(jià)肥胖/胰島素抵抗模型。正常血糖高胰島素鉗夾試驗(yàn):經(jīng)頸靜脈輸注短效胰島素和20%葡萄糖液,每10min經(jīng)頸動(dòng)脈取血測(cè)血糖,根據(jù)血糖值調(diào)節(jié)葡萄糖輸注速度,維持血糖水平在(5.0±0.28)mmol/L。計(jì)算穩(wěn)態(tài)時(shí)葡萄糖輸注速率(GIR)評(píng)估胰島素敏感性。1.2各組大鼠血清n、n、n、ffa、fg、fg-fg、fg-fg、fg-fg、fg/fg-fg、fg/lg-fg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/n,n+n的相關(guān)性研究見表1取造模成功的肥胖胰島素抵抗模型大鼠分為4個(gè)亞組,生理鹽水組(OB-NS組,n=7)、高葡萄糖組(OB-GS組,n=9)、高游離脂肪酸組(OB-FFA組,n=8)和高糖高脂肪酸組(OB-FG組,n=9)。肥胖各亞組Wistar大鼠行頸動(dòng)靜脈插管,休息72h,待大鼠體質(zhì)量和食量穩(wěn)定后輸注生理鹽水或葡萄糖和(或)脂肪乳,具體方法參照文獻(xiàn)1.3靜脈葡萄糖抗量試驗(yàn)ivrt用于評(píng)估細(xì)胞胰島素的分泌功能參照文獻(xiàn)1.4血脂、血脂指標(biāo)血漿葡萄糖采用氧化酶法測(cè)定,胰島素采用放射免疫分析藥盒(批內(nèi)CV<5%,批間CV<10%)檢測(cè),血脂采用奧林巴斯AU2700型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定,血胰高血糖素、FFA、β-HBA檢測(cè)采用比色法。1.5胰島細(xì)胞染色輸液結(jié)束后處死大鼠后取胰尾組織固定,制成4μm的連續(xù)組織切片,采用豚鼠抗人/鼠胰島素抗體(北京萊博公司公司)β細(xì)胞染色(DAKO公司)顯色,胰島細(xì)胞中胰島素染色陽性細(xì)胞(胞漿著染棕紅色顆粒)即胰島β細(xì)胞。采用華西醫(yī)院病理研究室Nikon圖象采集系統(tǒng),以Image-ProPlus6.0軟件進(jìn)行圖象分析,每組至少選10張切片,每張切片選3~5個(gè)胰島,測(cè)量平均光密度值代表單位面積細(xì)胞胰島素的量,測(cè)定每個(gè)胰島中染色陽性區(qū)域的總面積(S)代表β細(xì)胞量,用積分光密度(IOD)代表胰島中胰島素總的表達(dá)量,比較各組均值。1.6細(xì)胞凋亡,細(xì)胞磷酸酶染色本研究應(yīng)用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)凋亡細(xì)胞(羅氏診斷公司),采用兩種不同的顯色方法。先采用吖啶橙染色,熒光顯微鏡下觀察胰島細(xì)胞凋亡情況,由于石蠟切片本身容易在熒光下有綠色背景,所以高亮的綠色熒光點(diǎn)且與細(xì)胞核大小相差無幾表示有DNA損傷,為凋亡的細(xì)胞。再采用堿性磷酸酶染色,胞核染為橙紅色的為凋亡細(xì)胞。由兩位病理人員盲法閱片。每只大鼠至少取2張胰腺切片,每組至少取5只大鼠的胰腺切片,每張切片中至少計(jì)數(shù)3~5個(gè)胰島。β細(xì)胞凋亡率(%)=β細(xì)胞凋亡數(shù)/β細(xì)胞總數(shù)×100%。1.7統(tǒng)計(jì)方法計(jì)量數(shù)據(jù)組間比較用One-wayANOVA方差分析或秩和檢驗(yàn);各組凋亡率比較采用χ2結(jié)果2.1穩(wěn)態(tài)期血糖維持見表1。肥胖組大鼠空腹血清胰島素水平高于NC組(P<0.05),而正常血糖高胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)穩(wěn)態(tài)期血清胰島素水平兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鉗夾實(shí)驗(yàn)于60~120min進(jìn)入穩(wěn)態(tài),穩(wěn)態(tài)期血糖維持在(5.0±0.35)mmol/L左右,鉗夾穩(wěn)態(tài)期血糖變異指數(shù)(CVBG)為5.8%。維持正常血糖所需的GIR在肥胖組低于正常對(duì)照組(P<0.05),表明高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖/胰島素抵抗動(dòng)物模型成功建立。2.2大鼠內(nèi)臟和皮下脂肪的水平處死大鼠后,通過解剖分離出腹腔脂肪和皮下脂肪進(jìn)行稱重,發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)的肥胖大鼠的內(nèi)臟和皮下脂肪顯著多余普通飲食對(duì)照組,同時(shí)普通飲食組(NC組)的甘油三酯和膽固醇水平低于高脂肪飲食的各組。見表2。2.3各組均以酮體為特征OB-NS、FFA組和OB-GS和OB-FG組在輸液結(jié)束后血β-HBA水平均較基礎(chǔ)值升高,其中OB-FFA組和OB-FG組2.4各組大鼠輸注后糖代謝后各時(shí)間點(diǎn)胰島素水平正常對(duì)照組大鼠在靜脈推注葡萄糖后,血糖和胰島素分別于5min達(dá)到高峰,糖負(fù)荷后10~30min血糖水平逐漸下降,直至接近基線水平,胰島素與葡萄糖比值變化也呈相同趨勢(shì)。OB-NS組葡萄糖負(fù)荷后5~30min時(shí)血糖水平較NC組略高,糖負(fù)荷后5min胰島素達(dá)峰,5min后各時(shí)點(diǎn)胰島素釋放指數(shù)高于正常對(duì)照組,胰島素與血糖比值高于正常對(duì)照組。OB-FFA組和OB-GS組大鼠葡萄糖負(fù)荷后5min時(shí)出現(xiàn)胰島素分泌高峰,與NC組相比基線胰島素水平略高于正常對(duì)照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而胰島素峰值低于正常對(duì)照組,OB-FFA組與NC組胰島素峰值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),OB-FFA組和OB-GS組胰島素與血糖比值低于正常對(duì)照組和OB-NS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義OB-FG組大鼠糖負(fù)荷后胰島素分泌達(dá)峰時(shí)間延后且各時(shí)點(diǎn)胰島素水平明顯低于NC組和OB-NS組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖負(fù)荷后5~20min時(shí)血胰島素水平也明顯較OB-FFA組、OB-GS組降低。胰島素和血糖比值及胰島素釋放指數(shù)也均低于NC組和OB-NS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.5各組fg組長6周的搭建免疫組化染色圖像(附圖)顯示經(jīng)過葡萄糖或(和)脂肪乳輸注后,胰島素染色較NC組和OB-NS組淺,OB-FG組INS免疫組織化學(xué)染色淺淡最明顯,平均面積低于OB-NS組(P<0.01),但是與NC組差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OB-FG組在各亞組中IOD值最低,遠(yuǎn)低于NC組和OB-NS組(P<0.01),OB-GS組和OB-FFA組IOD值與OB-NS組比較也有不同程度降低(P<0.05)。見表4。2.6各組輸注后胰島細(xì)胞凋亡率與NC組細(xì)胞凋亡率相比,各OB大鼠亞組胰島細(xì)胞凋亡率增加,其中OB各亞組中以O(shè)B-FG組為顯著,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于NC組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。3糖尿病大鼠輸注后胰島素變化高脂飼料誘導(dǎo)8周及以上的肥胖大鼠是一種公認(rèn)的胰島素抵抗動(dòng)物模型既往基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡在β細(xì)胞分泌功能不足中扮演了重要的角色本課題組前期研究顯示葡萄糖/脂肪乳輸注后大鼠肝臟和骨骼肌細(xì)胞線粒體明顯腫脹,線粒體嵴斷裂,線粒體呈空泡樣改變,高糖高脂肪輸注后尤為明顯,胰島β細(xì)胞線粒體基質(zhì)明顯腫脹、嵴斷裂,同時(shí)胰島β細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)致密化,形成形狀不一,大小不等的團(tuán)塊邊集于核膜處綜上,本研究從多個(gè)方面證實(shí)糖脂協(xié)同毒性在引起肥胖大鼠FFA水平和酮體生成顯著增加的同時(shí)也導(dǎo)致胰島細(xì)胞分泌功能嚴(yán)重不足。肥胖個(gè)體在胰島素嚴(yán)重抵抗