合成冬蟲夏草誘發(fā)沙門氏菌基因突變的ames試驗研究

合成冬蟲夏草誘發(fā)沙門氏菌基因突變的ames試驗研究

婆羅洲的起源有兩種類型：天然婆羅洲和合成婆羅洲。天然冰片多為龍腦香科植物龍腦香樹脂的加工結晶品;合成冰片,是以樟腦、松節(jié)油為主要原料,經(jīng)化學方法合成的精制品,又名機片。合成冰片除含有龍腦外,還含有大量龍腦的差向異構體———異龍腦1材料和方法1.1材料表面1.1.1細粉末制備工藝合成冰片由天津天士力制藥股份有限公司提供,批號:20010923,試驗前將合成冰片研磨成細粉末,過140目篩,臨用前用二甲基亞砜(DMSO)配制成不同濃度受試液。1.1.2羥基1,8-a敵克松(Dexon);二氨基芴(2-AF);1,8-二羥基蒽醌(1,8-Dan),來源:美國Sigma公司,用DMSO配制,2～8℃保存,所有接觸陽性對照劑的試驗物品,如平皿、試管等均用專用塑料袋封裝,按同位素垃圾處理方式處理1.1.3s9代謝激活系統(tǒng)的制備肝臟微粒體酶(S9)活化系統(tǒng)的制備依照Ames法1.1.4tal00和taol2ce的構建采用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TAl00和TAl02共4株標準菌株(由北京軍事醫(yī)學科學院毒理研究所惠贈)。試驗菌株遺傳特性(組氨酸需求、rfa突變、紫外線敏感、氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性)經(jīng)鑒定均符合試驗要求。1.1.5兩組氨酸、生物素的含量頂層培養(yǎng)基:0.6%純瓊脂,含0.5%NaCl,0.05mol/L組氨酸或生物素。底層培養(yǎng)基:1.5%瓊脂水溶液,含2%葡萄糖和10倍Vogel-Bonner培養(yǎng)基(V-B儲存液),每500mL瓊脂水溶液中10倍V-B儲存液占100mL。1.2方法1.2.1梯度稀釋使受試物作用將合成冰片以DMSO配制成10g/L的母液,梯度稀釋使受試物作用于TA98和TAl00測試菌株的終濃度為1000、500、250μg/皿。每測試濃度在活化和非活化條件下各做3個平皿。1.2.2物的誘導誘導試驗同時設溶劑對照組(+/-S9mix)、空白(即自發(fā)回變)對照組(+/-S9mix),以及陽性誘變劑對照組,陽性物包括直接誘變劑敵克松(50.0μg/皿)———在無S9活化系統(tǒng)時作用于4株菌,間接誘變劑2-氨基芴(20.0μg/皿)———在有S9活化系統(tǒng)時作用于TA97、TA98、TAl00,間接誘變劑1,8-二羥基蒽醌(50.0μg/皿)———在有S9活化系統(tǒng)時作用于TAl02。共進行3批試驗,每批試驗每1濃度測試點在活化和非活化條件下各做兩個平行平皿。計算3批試驗的平均值。1.2.4回復突變菌落數(shù)測定按《新藥(中藥)臨床前研究指導原則》,如在1個或1個以上測試濃度誘發(fā)的回復突變菌落數(shù)比溶劑對照增加1倍以上,且具有劑量依賴關系,可判為陽性反應。任何菌株出現(xiàn)上述陽性反應時,均可判為試驗結果陽性。2結果2.1合成晶片檢測用TA98、TA100作為測試菌株進行的預試驗結果顯示,在1000μg/皿以上受試濃度下,當將合成冰片加入試驗系統(tǒng)時出現(xiàn)不同程度的白色析出,并且合成冰片在500μg/皿以上測試濃度下出現(xiàn)抑菌作用,據(jù)此,將受試物的最大測試濃度定為250μg/皿,按等比遞減原則,將誘變試驗中合成冰片受試濃度設置為250,50,10,2和0.4μg/皿。2.2鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果經(jīng)過48h的培養(yǎng)后,各劑量組的標準測試株菌苔生長情況良好。結果見表1。由表1可見,各試驗菌株自發(fā)回變率均在正常范圍,各菌株對相應的診斷性誘變劑均獲得明確的陽性反應,說明試驗系統(tǒng)可靠。合成冰片250、50、10、2和0.4μg/皿各劑量組,無論在加與不加S9活化系統(tǒng)條件下,對鼠傷寒沙門氏組氨酸合成缺陷菌株TA97、TA98、TAl00和TAl02回復突變的菌落數(shù)均在正常范圍內,與溶劑(DMSO)對照相比均無明顯增加,即均未超過溶劑對照的兩倍?？烧J為合成冰片對4株標準測試菌株均未顯示致突變性,Ames試驗結果陰性。3合成熱法藥物的安全性Ames試驗是1975年由美國加州大學生物化學教授AmesB.N.首次完整提出的突變(mutation)是指微生物基因組的核酸序列發(fā)生可遺傳的改變本試驗中,在加與不加S9活化系統(tǒng)的兩種條件下,合成冰片在0.4～250μg/皿濃度范圍內對TA97、TA98、TAl00和TAl02均未體現(xiàn)出誘發(fā)回變菌落數(shù)增加作用,合成冰片在Ames試驗中無致突變作用