細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存

二、種質(zhì)保留意義

伴隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展，地球不停開(kāi)發(fā)及生態(tài)環(huán)境破壞，每年都有多個(gè)物種消失或?yàn)l臨滅絕。各種植物，包含栽培種、野生種甚至雜草，都含有各自獨(dú)特優(yōu)良基因，是植物品種改良乃至農(nóng)業(yè)可連續(xù)發(fā)展基礎(chǔ)。它們是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)久進(jìn)化而來(lái)，一旦失去不會(huì)再來(lái)。所以，世界各國(guó)都很重視植物種質(zhì)資源搜集與保留研究。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第1頁(yè)三、種質(zhì)保留方法

按保留地理位置分為原地保留和異地保留。原地保留是在原來(lái)生態(tài)環(huán)境條件下,就地保留,自我繁殖品種資源,普通野生品種資源采取這種方式保留,如建立自然保護(hù)區(qū),天然公園等；異地保留是將種子或植株保留于該品種資源原產(chǎn)地以外地域,這種保留可采取植物園、種質(zhì)園、種質(zhì)庫(kù)等形式或采取試管保留形式。

按照保留詳細(xì)方法,品種資源保留可分為種植保留、貯藏保留、試管保留、基因文庫(kù)保留。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第2頁(yè)

1、種植保留

為了保持品種資源種子或無(wú)性繁殖器官生活力,并不停補(bǔ)充其數(shù)量,品種資源材抖須每隔一定時(shí)間播種一次,即種植保留。

在種植保留時(shí),種植條件盡可能與原產(chǎn)地相同,以降低因?yàn)樯鷳B(tài)條件改變而引發(fā)變異和自然選擇影響。在種植過(guò)程中應(yīng)盡可能防止或降低天然雜交和人為混雜。播種和收獲時(shí)取樣要有代表性以免因抽樣而造成遺傳漂移。總之要盡可能地保持原品種或類型遺傳特點(diǎn)和群體結(jié)構(gòu)。另外,對(duì)來(lái)自自然條件懸殊地域品種資源,可分別在不一樣生態(tài)地點(diǎn)異地種植保留。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第3頁(yè)細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第4頁(yè)

2、貯藏保留

貯藏保留就是用控制貯藏條件(主要是溫度和濕度)方法,來(lái)保持品種資源種子生活力。

長(zhǎng)久貯藏保留種子生活力技術(shù)關(guān)鍵是低溫和干燥,經(jīng)過(guò)控制種子周圍環(huán)境中溫濕度,迫使種子處于代謝作用最低程度。

貯藏保留種質(zhì)資源采取種質(zhì)庫(kù),種質(zhì)庫(kù)分三種：長(zhǎng)久庫(kù)、中期庫(kù)和短期庫(kù)。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第5頁(yè)細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第6頁(yè)3、基因文庫(kù)保留

利用DNA重組技術(shù)，將種質(zhì)材料總DNA或染色體全部片斷隨機(jī)連接到載體上，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)細(xì)胞增殖，組成各個(gè)DNA片斷克隆系。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第7頁(yè)細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第8頁(yè)第二節(jié)試管保留

一、常溫下試管保留

可利用試管苗繼代培養(yǎng)保留，但需要經(jīng)常更換培養(yǎng)基。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第9頁(yè)二、常溫抑制生長(zhǎng)保留

為了延緩繼代時(shí)間，可在培養(yǎng)基中添加長(zhǎng)抑制劑或提升滲透壓等。如脫落酸(ABA)、矮壯素（2-氯乙基三甲基氯化按，簡(jiǎn)稱CCC）、二甲氨基琥珀酸酰胺（簡(jiǎn)稱B9）、多效唑（PP333）等都是生長(zhǎng)抑制物質(zhì)，培養(yǎng)基中添加一定量能夠延緩生長(zhǎng)。普通情況下幾個(gè)月繼代一次，而添加這些物質(zhì)后，可到達(dá)一年甚至以上。

提升培養(yǎng)基滲透壓也能夠延緩生長(zhǎng)。可用蔗糖或甘露醇，濃度分別調(diào)到10%左右和4%—6%。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第10頁(yè)三、中低溫調(diào)控生長(zhǎng)保留

在試管苗繼代培養(yǎng)過(guò)程，適當(dāng)降低溫度，也能延緩生長(zhǎng)，延長(zhǎng)繼代時(shí)間。普通植物可調(diào)到1—9℃，熱帶、亞熱帶植物調(diào)至10—20℃。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第11頁(yè)四、常溫抑制生長(zhǎng)保留與中低溫調(diào)控生長(zhǎng)保留相結(jié)合

培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)抑制劑或提升滲透壓，培養(yǎng)溫度降低，使繼代時(shí)間延長(zhǎng)。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第12頁(yè)

第三節(jié)超低溫保留Cryopreservation

一、超低溫保留基本原理和主要步驟

在液氮中（-196℃），幾乎全部細(xì)胞代謝活動(dòng)停頓，僅保留細(xì)胞活力和形態(tài)發(fā)生潛力。當(dāng)解凍后，能夠恢復(fù)再生能力。

超低溫保留比較復(fù)雜，哪一步操作不妥，都會(huì)使細(xì)胞受傷害，失去再生能力。

注：超低溫通常指低于一

80℃低溫，保留介質(zhì)或容器有干冰(一79℃)、超低溫冰箱(-80-150℃)、液氮(-196℃)和液氮蒸氣相(-140℃)等，其中液氮最慣用。細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第13頁(yè)細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第14頁(yè)二、超低溫保留技術(shù)

1、保留材料選擇

2、冷凍前材料預(yù)處理

3、添加冷凍防護(hù)劑

4、材料冷凍方法（預(yù)冷）

5、材料保留

6、保留材料解凍

7、保留材料復(fù)蘇培養(yǎng)

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第15頁(yè)1、保留材料選擇

花粉、莖尖分生組織、芽、種胚、小植株、愈傷組織、體細(xì)胞胚等均能夠作為保留材料。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第16頁(yè)2、冷凍前材料預(yù)處理

為了使保留材料適應(yīng)超低溫條件，必須進(jìn)行預(yù)處理。

預(yù)處理方法：將保留材料放在高糖濃度、添加二甲基亞砜（DMSO）、脯氨酸，在靠近零度下培養(yǎng)數(shù)日。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第17頁(yè)3、添加冷凍防護(hù)劑

為了抵抗凍害，使用冷凍防護(hù)劑。慣用冷凍防護(hù)劑有：二甲基亞砜（DMSO）、甘油、脯氨酸、糖類、乙二醇、二甘醇、乙酰胺、福美氧化硫等。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第18頁(yè)4、材料冷凍方法

材料冷凍保留原理：冷凍時(shí)，細(xì)胞外溶液水分子，先形成冰晶中心，而冰晶形成速度與溶液成份、降溫速度相關(guān)。普通在-20℃—-60℃范圍內(nèi)，晶體中心增加最快，形成大塊冰晶體之后，慢慢減速，到-140℃時(shí)完全停頓增加。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第19頁(yè)4、冷凍處理

（1）快速冷凍

將植物材料從0℃

或者其它預(yù)處理溫度直接投入液氮中保留方法。降溫速度為1000℃/min。植物體內(nèi)水分在降溫冷凍過(guò)程中，從-10℃—-140℃范圍內(nèi)是冰晶形成和增加危險(xiǎn)溫度區(qū)，到-140℃時(shí)完全停頓增加，關(guān)鍵是利用高速降溫越過(guò)冰晶增加危險(xiǎn)溫度區(qū)，不能形成致死冰晶，細(xì)胞內(nèi)水分固化，不會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第20頁(yè)（2）慢速冷凍法

將植物材料從0℃

或者其它預(yù)處理溫度以降溫速度為1~2℃/min從起始溫度降到-100℃，穩(wěn)定1h后投入液氮中保留或以此降溫速度降至-196℃。

在這種降溫速度下，細(xì)胞內(nèi)水分有充分時(shí)間不停滲透到細(xì)胞外結(jié)冰，使細(xì)胞內(nèi)水分降低到最底程度，防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第21頁(yè)（3）預(yù)冷凍法

投入液氮前，需經(jīng)過(guò)短暫時(shí)間低溫鍛煉方法

①兩步冷凍：慢速冷凍至-40℃，停留一段時(shí)間，快速冷凍。

②逐層冷凍：材料經(jīng)過(guò)不一樣溫度等級(jí)降溫至-40℃，停留一段時(shí)間，投入液氮快速冷凍。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第22頁(yè)（4）干燥冷凍

將材料置于27~29℃烘箱內(nèi)降低植物含水量，在投入液氮中保留。此法能夠預(yù)防材料凍死。細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第23頁(yè)5、材料保留

-196℃液氮冰箱中或液氮罐中保留。

6、保留材料解凍

解凍速度是解凍技術(shù)關(guān)鍵，普通在37℃熱水浴中解凍。

解凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)輕易發(fā)生再結(jié)晶，而造成細(xì)胞死亡。

解凍速度快，來(lái)不及再結(jié)晶，細(xì)胞存活。

。

細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第24頁(yè)（1）快速解凍法

保留材料直接投入到37~40℃水浴中進(jìn)行解凍方法。-50~-10℃是再結(jié)冰溫度區(qū)

（2）慢速解凍

先置于0℃解凍，在逐步升溫至室溫。能夠使水分慢慢滲透細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞工程植物種質(zhì)保存第25頁(yè)7、保留材料復(fù)蘇培養(yǎng)