大腸菌群專題知識專家講座

食品中大腸菌群測定大腸菌群專題知識專家講座第1頁一大腸菌群概念及組成大腸菌群概念大腸菌群系指一群需氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖產酸、產氣革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群組成大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。大腸菌群專題知識專家講座第2頁二、大腸菌群測定意義1、糞便污染指標菌：大腸菌群或大腸桿菌2、以大腸菌群作為糞便指標菌原因（1）在糞便中數(shù)量最大；（2）在外環(huán)境中存活時間與致病菌大致相同；（3）檢測方法簡便輕易。

大腸菌群專題知識專家講座第3頁二、大腸菌群測定意義3、大腸菌群測定意義（1）判斷食品中否受到糞便污染。（2）有利于控制腸道傳染病發(fā)生和流行。（3）有利于控制食品在生產加工、運輸、保留等過程中衛(wèi)生情況。大腸菌群專題知識專家講座第4頁三、大腸菌群生物學特征1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產酸產氣3.培養(yǎng)特征：在ＥＭＢ瓊脂上經典菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上經典菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤。

大腸菌群專題知識專家講座第5頁糖發(fā)酵試驗大腸桿菌革蘭氏染色鏡下照片大腸菌群專題知識專家講座第6頁大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板上特征大腸菌群專題知識專家講座第7頁麥康凱瓊脂平板照片大腸菌群專題知識專家講座第8頁中華人民共和國國家標準

GB4789.3—食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)-03-26公布-06-01實施中華人民共和國衛(wèi)生部公布大腸菌群專題知識專家講座第9頁序言本標準代替GB/T4789.3-《食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》。本標準與GB/T4789.3-相比，主要修改以下：——修改了標準中英文名稱；——“第二法大腸菌群平板計數(shù)法”平板菌落數(shù)選擇范圍修改為“15CFU～150CFU”；——刪除了“第三法大腸菌群PetrifilmTM測試片法”。本標準附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。本標準所代替標準歷次版本公布情況為：——GB4789.3-1984、GB4789.3-1994、GB/T4789.3-、GB/T4789.3-。大腸菌群專題知識專家講座第10頁食品安全國家標準

食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)1范圍本標準要求了食品中大腸菌群（Coliforms）計數(shù)方法。本標準適合用于食品中大腸菌群計數(shù)。2術語和定義2.1大腸菌群coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產酸產氣需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。2.2最可能數(shù)mostprobablenumber，MPN基于泊松分布一個間接計數(shù)方法。大腸菌群專題知識專家講座第11頁3設備和材料除微生物試驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其它設備和材料以下：3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒溫水浴箱：46℃±1℃。3.4天平：感量0.1g。3.5均質器。3.6振蕩器。3.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。3.8無菌錐形瓶：容量500mL。3.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10pH計或pH比色管或精密pH試紙。3.11菌落計數(shù)器。大腸菌群專題知識專家講座第12頁4培養(yǎng)基和試劑4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯：見附錄A中A.1。4.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯：見附錄A中A.2。4.3結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：見附錄A中A.3。4.4磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.4。4.5無菌生理鹽水：見附錄A中A.5。4.6無菌1mol/LNaOH：見附錄A中A.6。4.7無菌1mol/LHCl：見附錄A中A.7。大腸菌群專題知識專家講座第13頁第一法大腸菌群MPN計數(shù)法5檢驗程序大腸菌群MPN計數(shù)檢驗程序見下列圖1。大腸菌群專題知識專家講座第14頁大腸菌群專題知識專家講座第15頁6操作步驟6.1樣品稀釋6.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水無菌均質杯內,8000r/min～10000r/min均質1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min，制成1:10樣品勻液。6.1.2液體樣品：以無菌吸管吸收25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水無菌錐形瓶（瓶內預置適當數(shù)量無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10樣品勻液。6.1.3樣品勻液pH值應在6.5～7.5之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調整。大腸菌群專題知識專家講座第16頁6.1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸收1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管重復吹打，使其混合均勻，制成1:100樣品勻液。6.1.5依據對樣品污染情況預計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完成，全過程不得超出15min。大腸菌群專題知識專家講座第17頁6.2初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜連續(xù)稀釋度樣品勻液（液體樣品能夠選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超出1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24h±2h產氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產氣者進行復發(fā)酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。大腸菌群專題知識專家講座第18頁6.3復發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產氣LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。大腸菌群專題知識專家講座第19頁6.4大腸菌群最可能數(shù)（MPN）匯報按6.3確證大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），匯報每g（mL）樣品中大腸菌群MPN值。大腸菌群專題知識專家講座第20頁第二法大腸菌群平板計數(shù)法7檢驗程序大腸菌群平板計數(shù)法檢驗程序見圖2。大腸菌群專題知識專家講座第21頁8操作步驟8.1樣品稀釋按6.1進行。8.2平板計數(shù)8.2.1選取2個～3個適宜連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。8.2.2及時將15mL～20mL冷至46℃結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。大腸菌群專題知識專家講座第22頁8.3平板菌落數(shù)選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)經典和可疑大腸菌群菌落。經典菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。8.4證實試驗從VRBA平板上挑取10個不一樣類型經典和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣，即可匯報為大腸菌群陽性。大腸菌群專題知識專家講座第23頁8.5大腸菌群平板計數(shù)匯報經最終證實為大腸菌群陽性試管百分比乘以8.3中計數(shù)平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個經典和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。大腸菌群專題知識專家講座第24頁附錄A

（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯A.1.1成份胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法將上述成份溶解于蒸餾水中，調整pH。分裝到有玻璃小倒管試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。大腸菌群專題知識專家講座第25頁A.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯A.2.1成份蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200mL0.1%煌綠水溶液13.3mL蒸餾水800mLpH7.2±0.1A.2.2制法將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調整pH至7.0～7.5），用蒸餾水稀釋到975mL，調整pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補足到1000mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。大腸菌群專題知識專家講座第26頁A.3結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）A.3.1成份蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或3號膽鹽1.5g中性紅0.03g結晶紫0.002g瓊脂15g～18g蒸餾水1000mLpH7.4±0.1A.3.2制法將上述成份溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調整pH。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45℃～50℃傾注平板。使用前暫時制備，不得超出3h。大腸菌群專題知識專家講座第27頁A.4磷酸鹽緩沖液A.4.1成份磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水500mLpH7.2A.4.2制法貯存液：稱取34.0g磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約1