41.8℃全身熱療對(duì)惡性腫瘤患者細(xì)胞免疫功能的影響

41.8℃全身熱療對(duì)惡性腫瘤患者細(xì)胞免疫功能的影響

作者：王遠(yuǎn)東呂俊宏周明趙建祈巖超

【摘要】［目的］探討℃全身熱療對(duì)惡性腫瘤患者細(xì)胞免疫功能的影響。［方法］分別在治療前后各個(gè)不同的時(shí)相抽取患者外周血樣本，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本中淋巴細(xì)胞亞群的百分含量、雙抗夾心ELISA法測(cè)定血清樣本中白細(xì)胞介素2和白細(xì)胞介素受體2的濃度。［結(jié)果］熱化療組患者在熱療期間Th/Ts比值上升至，NK細(xì)胞百分含量和血清IL2濃度上升超過3倍，免疫封閉因子sIL2R濃度由熱療前的2/ml顯著下降至1/ml，單純化療組患者未見上述改變。［結(jié)論］℃全身熱療發(fā)揮的是短期而顯著的效應(yīng)，有助于解除惡性腫瘤患者的免疫抑制，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫作用。

【關(guān)鍵詞】高溫,誘發(fā)；免疫細(xì)胞腫瘤輔助療法淋巴細(xì)胞亞群白細(xì)胞介素2白細(xì)胞介素2受體

Effectof℃WholeBodyHyperthermiaonCellularImmunityinPatientswithMalignancy

Abstract:［Purpose］ToinvestigatetheEffectsof℃WholeBodyHyperthermiaoncellularimmunityinpatientswithmalignancy.［Methods］PeripheralbloodsamplesfrompatientsbeforeandaftertreatmentweredetectedbyflowcytometryforpercentageoflymphocytesubsetsandELISAforconcentrationofIL2andsIL2R.［Results］Inpatientswithhyperthermiaandchemotherapy,duringtreatmentwithhyperthermia,theTh/Tsradioelevatedto,thepercentageofNKcellandIL2concentrationrosetoover3timesandtheconcentrationofsIL2Rdecreasedfrom2pg/mlbeforehyperthermiato1pg/ml.Theabovechangeswerenotobservedinpatientswithchemotherapyalone.［Conclusion］℃WholeBodyHyperthermiawiththetransientandconspicuouseffectcanrelieveimmunesuppressionandenhanceantitumorimmunityinthepatientswithmalignancy.

Keywords:hyperthermia,induced;immunity,cellular;neoplasms;adjuvanttherapy;lymphocytesubsets;

interleukin2;interleukin2receptors

interleukin2receptor，sIL2R）

熱療已經(jīng)成為了繼手術(shù)、放療、化療和生物治療之后又一重要的腫瘤治療手段。全身熱療的治療機(jī)制目前還不完全清楚，但其治療效果已經(jīng)被假設(shè)歸因于免疫系統(tǒng)的激活，機(jī)體免疫狀態(tài)的激活對(duì)消滅腫瘤起著重要作用。惡性腫瘤患者處于免疫功能抑制狀態(tài)[1]，而細(xì)胞免疫功能紊亂占主要地位。研究表明熱療效果不僅在于高熱直接殺死腫瘤細(xì)胞，熱療過程機(jī)體免疫系統(tǒng)也會(huì)發(fā)生明顯改變，適當(dāng)溫度的WBH可增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的免疫功能，促進(jìn)白細(xì)胞介素2(interleukin2，IL2)的生成，并使腫瘤局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加。為了觀察℃WBH對(duì)惡性腫瘤患者細(xì)胞免疫功能的影響，我們對(duì)比了熱療聯(lián)合化療與單純化療兩組惡性腫瘤患者治療前后各時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞亞群及血清IL2、可溶性白細(xì)胞介素2受體水平的變化，從而為熱療的治療機(jī)制和臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

研究對(duì)象

惡性腫瘤患者均為廣州市腫瘤醫(yī)院2004年7月～2005年7月間的住院病人，其中熱化療組25例，男性16例，女性9例，包括直腸癌10例，結(jié)腸癌7例，食管癌4例，非小細(xì)胞肺癌2例，乳腺癌肺轉(zhuǎn)移1例，小細(xì)胞肺癌1例。此組病人均接受℃全身熱療，同時(shí)與熱療同步予含鉑類藥物的化療?；熃M6例，男性4例，女性2例,包括直腸癌3例，結(jié)腸癌1例，非小細(xì)胞肺癌2例，只予含鉑類藥物的化療。

熱療過程及采血時(shí)間

全身熱療采用ETSPACETMI紅外線體表照射全身熱療系統(tǒng)(深圳市一體智能技術(shù)有限公司)，熱療過程大約6h，包括4h加熱期，60～℃的平臺(tái)期，30～60min的降溫期。分別于熱療前或化療前，熱療平臺(tái)期末或化療中，熱療或化療結(jié)束時(shí)，熱療后24h或化療后24h，熱療后48h或化療后48h，抽取患者外周靜脈血3ml，其中1ml置肝素抗凝管即送流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，2ml置無抗凝管即行血清提取后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

流式細(xì)胞術(shù)行淋巴細(xì)胞亞群分析

用直接免疫熒光技術(shù)測(cè)定樣本淋巴細(xì)胞各亞群細(xì)胞百分率，經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACScan，USA)分析結(jié)果。將經(jīng)肝素抗凝的外周靜脈血混勻后取50μl加入含有凍干的已知數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)熒光微球的絕對(duì)計(jì)數(shù)管，加入用異硫氰酸(FITC)或藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的各種小鼠抗人單克隆抗體：FITCCD3/PECD16，56，F(xiàn)ITCCD4/PECD8雙標(biāo)記單抗和FITCCD19單標(biāo)記單抗各20μl(以上儀器和試劑均為BectonDickinson公司生產(chǎn)),置室溫暗處反應(yīng)20min后再加入紅細(xì)胞溶解劑450μl，充分混勻，室溫暗處反應(yīng)30min后上機(jī)。經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析CD3+(全T細(xì)胞)，CD4+CD8-(輔助T細(xì)胞，Th細(xì)胞)，CD4-CD8+(抑制T細(xì)胞，Ts細(xì)胞)，CD16+56+(自然殺傷細(xì)胞，NK細(xì)胞)和CD19+(全B細(xì)胞)細(xì)胞百分率。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法測(cè)定血清IL2、sIL2R含量

采用ELISA雙抗體夾心法測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出。

統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件分析，統(tǒng)計(jì)方法為ANOVA。

2結(jié)果

各時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞亞群的變化

T淋巴細(xì)胞亞群的變化

如表1、2和圖1所示，熱化療組病人在熱療期間T淋巴細(xì)胞含量包括Th細(xì)胞和Ts細(xì)胞持續(xù)下降，從起始％下降至熱療結(jié)束時(shí)最低值％，較熱療前有顯著性差異，熱療后24h全面恢復(fù)接近起始水平，其后的24h又顯著下降，其中Th細(xì)胞與Ts細(xì)胞的變化趨勢(shì)相類似，但Th/Ts比值在熱療期間持續(xù)上升，至熱療結(jié)束時(shí)達(dá)到高峰，熱療后48h內(nèi)逐漸下降至起始水平；化療組病人在化療期間Th細(xì)胞和Ts細(xì)胞含量均有下降，Th細(xì)胞在化療后逐漸上升，至化療后48h已高于起始水平，而Ts細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)均稍低于起始值，Th/Ts比值只是在化療中小升至，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

NK細(xì)胞的變化

由表1、2和圖2可見，熱療作用使熱化療組病人的NK細(xì)胞含量由起始的18%陡升至54%，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)，并隨著體溫的下降而恢復(fù)至起始水平，熱療后仍有緩慢上升；化療組病人NK細(xì)胞含量變化不大，在各時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異。

B細(xì)胞的變化

兩組病人的B細(xì)胞含量受熱化療或化療的影響不大，在各時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異。

各時(shí)間點(diǎn)血清IL2、IL2R的變化

血清IL2的變化

如表3、4和圖3所示,熱療作用使熱化療組病人血清中IL2濃度由起始的pg/ml上升至pg/ml，較熱療前顯著升高，在熱化療后48h依然保持16pg/ml的濃度，也顯著高于熱療前；而化療組病人血清IL2濃度則持續(xù)下降，由化療前的/ml降到化療后48h的pg/ml。

sIL2R的變化

如表3、4和圖4所示,sIL2R的濃度在熱化療作用下與IL2的變化相反，由熱療前的2pg/ml顯著下降至熱療中1pg/ml，并隨著溫度的下降逐漸上升，直至熱療后48h達(dá)到2/ml的高峰。而化療組病人在化療中明顯上升至2578pg/ml，顯著高于化療前。

3討論

用各種方法提高全身和腫瘤組織的溫度，利用熱作用及其繼發(fā)效應(yīng)來治療惡性腫瘤，稱為腫瘤熱療。大量研究表明，WBH的抗腫瘤作用并不是因?yàn)闊嵝?yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷，其主要作用包括：增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能、抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)其它腫瘤治療方法(如化療、放療等)的效果等。

機(jī)體抗腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，其中Ｔ淋巴細(xì)胞亞群起主導(dǎo)作用，CD4+細(xì)胞代表輔助性T細(xì)胞(Th)，CD8+則是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和抑制性T(TS)細(xì)胞的共同標(biāo)志，Th細(xì)胞依賴抗原呈遞細(xì)胞呈遞相關(guān)的腫瘤抗原，被其特異性激活后分泌淋巴因子導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的損傷或溶解死亡，TS細(xì)胞通過分泌γ干擾素抑制IgG1的產(chǎn)生而發(fā)揮免疫抑制作用。我們看到℃WBH期間T細(xì)胞含量包括CD4＋細(xì)胞和CD8＋細(xì)胞全面下降，但CD4＋/CD8＋比值呈上升趨勢(shì)，幅度高于化療組，熱療后才開始回降。而單純化療的患者CD4＋細(xì)胞和CD8＋細(xì)胞在化療期間及其后的48h內(nèi)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，CD4＋/CD8＋比值只是在化療中稍有上升，提示℃WBH可使CD4＋/CD8＋比值有所上調(diào)，但效應(yīng)是短暫的，隨著體溫恢復(fù)而下降，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。在以往的體外實(shí)驗(yàn)中，溫度的升高可誘導(dǎo)正常淋巴細(xì)胞的程序性死亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則證明，WBH期間淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞的凋亡率上升，推測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞總數(shù)下降可能與熱療誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的凋亡有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)也能觀察到類似現(xiàn)象。

自然殺傷細(xì)胞可直接或間接誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，被視為機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的第一道防線。CD16+56+是NK細(xì)胞的標(biāo)志，本研究可看到CD16+56+細(xì)胞含量受體溫的影響非常顯著，℃WBH使惡性腫瘤患者的CD16+56+細(xì)胞呈早期而短程的明顯升高，并隨體溫的下降而回降，熱療后48h內(nèi)無明顯上升，結(jié)果與Dieing等的報(bào)道類同，而化療組患者的CD16+56+細(xì)胞則看不到如此的變化?？梢姟鎃BH可能通過上調(diào)NK細(xì)胞的數(shù)量與活性發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

IL2是由輔助性Ｔ細(xì)胞產(chǎn)生的一種免疫調(diào)節(jié)因子，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮非常重要的作用。它通過細(xì)胞膜上IL2受體(mIL2R)與細(xì)胞相互作用，從而刺激T細(xì)胞生長(zhǎng)，參與NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞殺瘤活性的激活。sIL2R是近年來公認(rèn)的免疫封閉因子，sIL2R系由mIL2Roc鏈部分脫落而成，它的釋放使mIL2R減少，促使活性細(xì)胞恢復(fù)到休止期，同時(shí)sIL2R與mIL2R競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL2，封閉IL2的刺激淋巴細(xì)胞及克隆增殖作用，起一定的免疫抑制效應(yīng)。國(guó)外眾多研究[8~10]表明IL2/sIL2R系統(tǒng)的水平有助于腫瘤患者的病情監(jiān)測(cè)，療效觀察及預(yù)后判斷，sIL2R水平越高，常提示患者的病情較重，預(yù)后越差。我們的實(shí)驗(yàn)表明℃WBH使惡性腫瘤患者外周血IL2的濃度顯著上升3倍以上，sIL2R濃度從2113pg/ml下降至1506pg/ml，均有顯著性差異，復(fù)溫過程IL2即逐漸回降，sIL2R則馬上上升，熱療后48h內(nèi)IL2的濃度仍然高于起始值，并仍緩慢上升，sIL2R則繼續(xù)顯著上升，而化療組患者IL2/sIL2R系統(tǒng)則沒有出現(xiàn)上述變化，說明惡性腫瘤患者體內(nèi)的IL2/sIL2R系統(tǒng)水平受熱效應(yīng)影響明顯并靈敏，這與Atanackovic的研究一致。

綜上所述，℃WBH發(fā)揮的是短期而顯著的效應(yīng)，能夠使惡性腫瘤患者Th/Ts比值上升，NK細(xì)胞含量、血清IL2濃度顯著提高，免疫封閉因子sIL2R濃度顯著下調(diào)，有助于解除惡性腫瘤病人的免疫抑制，達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫作用。

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