臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控

臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控衛(wèi)生部臨床檢查中心李金明第1頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控概念不清不懂得詳細(xì)怎么做不會寫室內(nèi)質(zhì)控SOP不懂得如何選擇室內(nèi)質(zhì)控物不會分析室內(nèi)質(zhì)控成果第2頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控責(zé)任人不清。質(zhì)控物起源及濃度不清或不全，并且一般沒有說明陰性質(zhì)控物起源。有些是自制，但制備辦法不規(guī)范，沒有任何質(zhì)量檢查，定量成果沒有溯源性。沒有明確所選用質(zhì)控辦法。對前20次測定室內(nèi)質(zhì)控沒有處理辦法。沒有明確失控判斷標(biāo)準(zhǔn)，只是做了某些失控含糊論述。并且一般都沒有陰性失控判斷辦法。沒有失控后分析及處理措施。第3頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控由試驗(yàn)室工作人員，采取一定辦法和步驟，連續(xù)評價本試驗(yàn)室工作可靠性程度，意在監(jiān)測和控制本試驗(yàn)室工作精密度，提升本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢查一致性，以確定測定成果是否可靠、可否發(fā)出報告一項(xiàng)工作。可概括為:(1)執(zhí)行者：試驗(yàn)室技術(shù)人員；(2)目標(biāo)：監(jiān)測試驗(yàn)室測定反復(fù)性；(3)功能：決定了當(dāng)批測定有效性，報告可否發(fā)出。是對試驗(yàn)室測定即時性評價。

第4頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控主要包括三個方面：（1）測定前質(zhì)量控制；（2）統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制；（3）質(zhì)量控制評價。第5頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控試驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理抱負(fù)試劑和操作辦法人員培訓(xùn)

第6頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控試驗(yàn)室空間及工作流程設(shè)計(jì)試驗(yàn)室環(huán)境條件控制：溫濕度控制設(shè)備、穩(wěn)壓或不間斷電源第7頁抱負(fù)PCR試驗(yàn)室設(shè)計(jì)A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)第8頁產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)抱負(fù)PCR試驗(yàn)室設(shè)計(jì)B第9頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作“十六字口訣”第10頁產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗第11頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控“無基因”概念試驗(yàn)室要有嚴(yán)格人員進(jìn)入限制和程序使用合格試劑和消耗品第12頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控臨床標(biāo)本中存在大量待測微生物科研中得到質(zhì)?？寺〈饲胺治鲅芯刻囟ㄎ⑸锎罅看嬖谟谠囼?yàn)環(huán)境中特定微生物此前擴(kuò)增產(chǎn)物殘留污染。這也是PCR試驗(yàn)室最容易產(chǎn)生將造成假陽性“污染”。

第13頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控試驗(yàn)室嚴(yán)格分區(qū)及工作程序嚴(yán)格遵守

化學(xué)辦法：試驗(yàn)臺面可使用10％次氯酸鈉（漂白劑）清洗；有些物品例如放置擴(kuò)增反應(yīng)管盤必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時，在轉(zhuǎn)回之前，應(yīng)將其置于2％~10％次氯酸鈉溶液中過夜，并充足沖洗。紫外照射：試驗(yàn)臺面、儀器設(shè)備、試驗(yàn)室空間UNG第14頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控PCR儀、離心機(jī)、加樣器、恒溫設(shè)備等應(yīng)建立技術(shù)檔案，并定期維護(hù);PCR儀、加樣器、恒溫設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)第15頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控核酸提取或標(biāo)本處理辦法抗干擾能力（能否有效地去掉PCR抑制物）測定下限(Detectionlimit)（定性測定）測定精確性和線性范圍批內(nèi)變異和批間變異試劑批間一致性有否污染其他：外包裝、試劑完整性、有效期、說明書等第16頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控按照試劑盒說明書操作即可嗎?操作中影響測定成果關(guān)鍵步驟寫出具有可操作性SOP第17頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控培訓(xùn)所包括范圍:儀器設(shè)備使用、維護(hù)和校準(zhǔn)；試劑、辦法原理；質(zhì)量管理體系；有關(guān)法律法規(guī)、有關(guān)領(lǐng)域新技術(shù)、新理念和新進(jìn)展；試驗(yàn)操作技能等。如何培訓(xùn)：講座、討論、自學(xué)和參與培訓(xùn)班等。培訓(xùn)評定：書面考試、試驗(yàn)考評、討論心得、論文、綜述等。第18頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控物濃度選擇每次（批）測定質(zhì)控物數(shù)量及放置質(zhì)控規(guī)則Levey-Jennings質(zhì)控圖辦法“即刻法”質(zhì)控辦法“假陽性”統(tǒng)計(jì)質(zhì)控辦法第19頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控定量測定：測定線性范圍內(nèi)高、中、低三種濃度定性測定：接近辦法測定下限濃度陰性質(zhì)控物第20頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)本數(shù)量如不大于30，弱陽性和陰性質(zhì)控各1份，標(biāo)本數(shù)量增加，質(zhì)控物數(shù)量對應(yīng)按百分比增加均勻分散于臨床標(biāo)本中，與臨床標(biāo)本一同處理（核酸提?。U(kuò)增時排列次序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。但在擴(kuò)增儀中位置，不應(yīng)永久性固定在一種孔，而應(yīng)在每次擴(kuò)增檢測時，進(jìn)行對應(yīng)順延，以使在一定時間內(nèi)，能夠盡也許監(jiān)測每一種孔擴(kuò)增有效性。第21頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控陰性原血清樣本試驗(yàn)過程中帶入空管僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液管第22頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測試驗(yàn)室此前擴(kuò)增產(chǎn)物“污染”由試驗(yàn)操作所致標(biāo)本間交叉污染。詳細(xì)地說，如強(qiáng)陽性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致污染、強(qiáng)陽性標(biāo)本經(jīng)操作者手所致污染、使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫孵育時蓋子崩開等擴(kuò)增反應(yīng)試劑污染。

第23頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測核酸提取過程中試驗(yàn)室“污染”存在（在整個試驗(yàn)過程中，開口放置于核酸提取操作臺面區(qū)域內(nèi)，最后以水為基質(zhì)，進(jìn)行擴(kuò)增

）第24頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測試劑“污染”第25頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控規(guī)則體現(xiàn)方式質(zhì)控規(guī)則功能常用質(zhì)控規(guī)則符號及定義

第26頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控一般質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表達(dá)，其中A為質(zhì)控測定中超出質(zhì)量控制限測定值個數(shù)，L為控制限，一般用均值或均值±1～3SD來表達(dá)。當(dāng)質(zhì)控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。常用13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中A，3s為原式中L，表達(dá)均值±3s，其確切含義為：在質(zhì)控測定值中，假如有一種測定值超出均值±3s范圍，即可將該批測定判為失控。第27頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控簡單地說就是用于判斷測定批失控還是在控。第28頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控符號

定義12S

一種質(zhì)控測定值超出±2s控制限。13S

一種質(zhì)控測定值超出±3s控制限。22S

兩個連續(xù)質(zhì)控測定值同步超出+2s或－2s控制限。R4S

同一批測定中，兩個不一樣濃度質(zhì)控物測定值之間差值超出4s控制限。41S

四個連續(xù)質(zhì)控測定值同步超出+1s或－1s控制限。7T

七個連續(xù)質(zhì)控測定值展現(xiàn)一種向上或向下趨勢變化。10X

十個連續(xù)質(zhì)控測定值同步處于均值（）同一側(cè)。第29頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制。二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢查質(zhì)量控制。經(jīng)Henry和Segalove改良，即為目前常用Levey-Jennings質(zhì)控圖。第30頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控第31頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控穩(wěn)定條件下，在20個IQC成果中不應(yīng)有多于1個成果超出2SD（95.5%可信限）程度；在1000個測定成果中超出3SD（99.7%可信限）成果不多于3個。如以±3s為失控限，假失控概率為0.3%。第32頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控“即刻法”質(zhì)控辦法實(shí)質(zhì)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)辦法，即Grubs異常值取舍法；只要有3個以上數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值存在。第33頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控基于日常檢查陽性率比值(呈正態(tài)分布)直接概率計(jì)算辦法（不呈正態(tài)分布）第34頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控半Levey-Jennings質(zhì)控圖法第35頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控當(dāng)陰性質(zhì)控樣本為陽性時,不論陽性率測定比值為何，均為失控，所有陽性標(biāo)本須重新測定，并增加一倍陰性質(zhì)控樣本。假如陰性質(zhì)控樣本為陰性，某次測定陽性比值超出+3SD,則為失控,為1+3S規(guī)則。本次成果陰性成果根據(jù)陽性質(zhì)控樣本情況,決定是否能夠發(fā)出,所有陽性樣本成果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽性率增高原因，并在增加一倍陰性質(zhì)控樣本情況下重新檢測。第36頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控曲線向上漂移：提醒出現(xiàn)污染，污染也許是由于某一天操作上失誤造成試驗(yàn)室被污染如標(biāo)本泄漏，產(chǎn)物泄漏，試劑被污染等向上趨勢性變化：也許存在累積性產(chǎn)物污染，試驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸累積，從而使病人成果陽性率逐漸增高。此時試驗(yàn)室需要進(jìn)行徹底清潔。第37頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控按統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，一種事件發(fā)生概率不大于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生也許性很小。當(dāng)一種小概率事件發(fā)生時，則也許有誤差存在，有必要對其發(fā)生原因進(jìn)行分析。對每天日常病人成果中陽性率出現(xiàn)概率進(jìn)行計(jì)算，假如這種成果出現(xiàn)概率不大于5%時，則可判為失控。第38頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控在一種試驗(yàn)室中某檢測項(xiàng)目成果陽性率為p,計(jì)算在n個血液樣本中有k個陽性成果概率。根據(jù)二項(xiàng)式分布概率計(jì)算公式如下：

P(X=k)=n!/[k!(n-k)!]pk(1-p)n-k(1)

其中n為當(dāng)次試驗(yàn)檢測標(biāo)本數(shù)，k為陽性個數(shù)，p為陽性率。P(X=k)

5%為失控。此時，陰性標(biāo)本能夠發(fā)出報告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。第39頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控假如一種試驗(yàn)室檢測HBVDNA，日常病人成果陽性率為10%，即p=0.1,在某一次檢測25個樣本出現(xiàn)6個陽性成果，19個陰性成果，則檢測過程中是存在污染也許性可通過下述辦法計(jì)算。即計(jì)算在25個樣本中出現(xiàn)6個或6個以上陽性成果概率，此時概率為1-（取得0個或1個或2個或3個或4個或多5個陽性成果概率）即：1-[P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)]=1-[(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15]=0.0334則在這個試驗(yàn)室一次檢測25個標(biāo)本取得6個或6個以上陽性成果概率為3.34%，不大于5%，屬于小概率事件，即發(fā)生也許性很小，也許有污染所致假陽性成果也許。第40頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控在血液篩查檢測中，許多試驗(yàn)室或檢測項(xiàng)目如HCVRNA、CT、結(jié)核桿菌、淋球菌陽性成果率均較低，這時雖然能夠使用公式（1）計(jì)算概率，但假如標(biāo)本量很大，使用泊松分布來估計(jì)二項(xiàng)式分布是一種更為簡便辦法。。根據(jù)泊松分布，可使用下式計(jì)算概率：

P(X=k)=(np)ke-np/k!(2)

P(X=k)

5%為失控。此時，陰性標(biāo)本能夠發(fā)出報告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。第41頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控一種試驗(yàn)室中，某項(xiàng)目每次檢測成果陽性率約為2%，則在100個樣本中出現(xiàn)8個陽性成果概率。根據(jù)泊松分布，可使用公式（2）計(jì)算概率，此時n=100,p=0.02,k=8,np=2代入公式（2）計(jì)算得

P(X=10)=28e-2/8!=0.0009。第42頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控假如所有陽性成果出現(xiàn)是連續(xù)性，則也許存在標(biāo)本間交叉污染，即陽性樣本污染了它鄰近陰性樣本，這種情況概率計(jì)算公式如下：

P=(n-r+1)/[n!/r!(n-r)!]（3）其中n為當(dāng)次試驗(yàn)檢測標(biāo)本數(shù)，r為連續(xù)出現(xiàn)陽性個數(shù)。當(dāng)某次實(shí)際測定標(biāo)本連續(xù)陽性概率大于所計(jì)算概率，則判為失控。陰性標(biāo)本成果能夠發(fā)出，陽性標(biāo)本要考慮標(biāo)本間交叉污染問題。第43頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控如在一次檢測100個標(biāo)本HBVDNA檢測中，所有兩個陽性成果連續(xù)出現(xiàn)概率為：

P=(100-2+1)/[100!/2!(100-2)!]=99/4950=0.02概率為2.0%。

因此，如在100個標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)兩個為陽性次數(shù)有3次，即概率為3.0%，則為失控。而在一次檢測100個標(biāo)本，所有三個陽性成果連續(xù)出現(xiàn)概率為：

P=(100-3+1)/[100!/3!(100-3)!]=98/161700=0.0006概率為0.06%。

因此，假如如在100個標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)三個為陽性次數(shù)有1次，即概率為1.0%，為失控。第44頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控IQC是一種集體活動，不光是對試驗(yàn)室一次測定有效性判斷，也反應(yīng)了試驗(yàn)室測定趨勢變化。IQC失控不能做為處罰根據(jù)，應(yīng)建設(shè)性找出失控原因，針對其采取措施加以改善。對IQC應(yīng)定期進(jìn)行評價。第45頁臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控核酸提取中隨機(jī)誤差。如核酸提取中丟失、有機(jī)溶劑清除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物殘留、所用耗材如離心管有PCR抑制物等。儀器問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度不一致性等。試劑問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶失活、探針純度及標(biāo)識效率和核酸提取試劑效率等。第46頁陽性質(zhì)控樣本測定成果偏低或?yàn)殛幮猿晒完幮耘R床標(biāo)本中無強(qiáng)陽性臨床標(biāo)本中有較強(qiáng)陽性臨床標(biāo)本中有陽性臨床標(biāo)本全為陰性觀測臨床標(biāo)本情況所用離心管含抑制物Taq酶活性減少核酸提取試劑效率低更換進(jìn)口離心管更換Taq酶再檢測更換核酸提取試劑所有標(biāo)本重新檢測核酸提取中靶核酸丟失核酸提取中抑抑物殘留核酸提取試劑混入擴(kuò)增儀孔間溫度差異隨機(jī)誤差檢測質(zhì)控樣本及3~5份已知陽性樣本質(zhì)控樣本測定正常且陽性樣本有些值增加質(zhì)控及已知陽性樣本測定仍異常按系統(tǒng)誤差途徑分析重新提取或已知濃度DNA在同一孔內(nèi)擴(kuò)增成果正常成果仍低進(jìn)行擴(kuò)增儀