應(yīng)用流式細胞儀檢測CD34-細胞方法學評價

應(yīng)用流式細胞儀檢測CD34+細胞方法學評價

應(yīng)用流式細胞術(shù)(FACS)測定動員后的外周血及采集的自體外周血造血干細胞(APBSC)中的CD34+細胞及其亞群，操作簡單、快速、重復(fù)性好，對及時掌握最佳采集時機，準確判斷采集的干/祖細胞數(shù)量具有重要指導意義。為準確檢測外周血及APBSC中的CD34+細胞，本文比較了幾種FACS檢測CD34+細胞方法的異同。

1材料與方法

外周血造血干細胞APBSC采集自經(jīng)環(huán)磷酰胺＋重組人粒細胞集落刺激因子動員后的實體瘤患者，采集使用CS3000-Plus血細胞分離機。

CD34+細胞的標記對10份APBSC分別進行2種不同再處理與CD34標記。

溶血法APBSC與CD34-PE熒光單克隆抗體室溫暗處反應(yīng)15min，然后用細胞裂解液溶解紅細胞，待測。

分離單個核細胞法經(jīng)Ficoll梯度離心，收集界面層單個核細胞，與CD34-PE標記的單抗室溫孵育15min，待測。

FACS檢測CD34+細胞上述標記細胞懸液分為2管，其中一管6h內(nèi)使用流式細胞儀測定CD34+細胞占單個核細胞的百分率，另一管經(jīng)1％多聚甲醛固定，4℃冰箱保存72h后，F(xiàn)ACS測定CD34+細胞數(shù)。

熒光標記的CD34單克隆抗體33份APBSC同時分別用表達第2類抗原表位QBEnd10和表達第3類抗原表位8G12的單抗進行標記，比較2組CD34+細胞百分率之間的差異。

雙標記CD34/CD45APBSC中同時加入抗CD45-FITC和抗CD34-PE，用溶血法處理細胞，F(xiàn)ACS測定CD34+細胞。

統(tǒng)計學處理用t檢驗。

2結(jié)果

溶血法與單個核細胞標記法測得CD34+細胞百分率無顯著性差異。

同一樣品經(jīng)1％多聚甲醛固定72h后的測定值與6h內(nèi)的測定值相比，CD34+細胞熒光強度降低，非特異吸附增加，變異系數(shù)范圍在％～％之間，平均CV值為％。

APBSC標本分別用2種CD34單體標記，CD34+細胞百分率無顯著性差異。

CD34-PE／CD45-FITC雙標記測定APBSC中CD34+細胞的百分率為％，而同一組樣品進行CD34+細胞單色標記為％。

3討論

FACS雖然對CD34+細胞的檢測具有決定性意義，但早期造血干細胞表面CD34抗原表達弱且少，標本保存、不同標記方法及固定劑的使用均會影響CD34+細胞結(jié)果［1］。本研究對樣品固定前、后測定，CV值明顯大于批內(nèi)變異，應(yīng)在1％～6％，批間變異＜20％的國際質(zhì)控標準［2］。樣品的2種不同處理方法間雖無顯著性差異，但溶血法較分離單個核細胞法簡單，避免了細胞損傷，使細胞回收率提高［2］，更適于臨床應(yīng)用。CD34抗原表位可分為3類，其抗原表達亦有差異，應(yīng)用針對不同表位的抗體測定CD34+細胞，結(jié)果是否有差異，則報道不一［3,4］。本研究的結(jié)果表明無顯著性差異。

各實驗室對CD34+細胞標記與測定目前尚無統(tǒng)一的標準方法，必然會產(chǎn)生較大的室間差異，Lowdell等對28份APBSC在15個實驗室進行室間分析，結(jié)果差異很大，CD34+細胞為∶％～％，CV值為％～％［1］。1995年初，國際血液治療與移植工程協(xié)會成立了干細胞計數(shù)委員會，建立了一種簡單、快速、靈敏的計數(shù)CD34+細胞的方法［5］，建議雙標記CD34-PE／CD45-FITC計數(shù)CD45+細胞中CD34+細胞的百分率，因為白細胞共同抗原CD45在造血干／祖細胞上的表達明顯減弱，CD45和側(cè)向散射光一起可以較好地把CD34+細胞和淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、死細胞、細胞碎片、血小板團塊及有核細胞區(qū)分開［4］。此外還可以同時結(jié)合第3種熒光抗體，測定CD34+細胞亞群［5］。

應(yīng)用FACS測定CD34+細胞應(yīng)遵循以下原則∶選用特異性及敏感性高的單體，CD34單抗結(jié)合PE效果要強于FITC［6］；由于CD34+細胞表達很少，應(yīng)計數(shù)盡可能多的細胞，以提高結(jié)果的準確性［7］；標本應(yīng)新鮮測定；同時標記CD45，可提高檢測CD34+細胞的準確性。

參考文獻：

［1］LowdellMW,BainbridgeDR.ExternalqualityassuranceforCD34cellenumeration-resultsofapreliminarynationaltrial.BoneMarrowTrans-plantation,1996;17(5):849

［2］SienaS,BregniM,BrandoBetal.Flowcytometryforclinicalestimationofcirculatinghematopoieticprogenitorsforautologoustransplantationincancerpatients.Blood,1991;77(2):400

［3］TitleyI,HealyLE,ScottMetal.ExtentofvariabilityinherentinmeasurementsofCD34-positivecellsindifferenthumanhemapoietictissues.BoneMarrowTransplantation,1995;16(4):611

［4］SutherlandDR,KeatingA,NayarRetal.SensitivedetectionandenumerationofCD34+cellsinperipheralandcordbloodbyflowcytometry.ExpHematology,1994;22(10):1003

［5］SutherlandDR,AndersonL,KeeneyMetal.TheISHAGEforCD34+celldeterinationbyflowcytometry.JHematotherapy,1996;5(3):213

［6］LumleyMA,McDonaldDF,CzarneckaHMetal.QualityassuranceofCD34+cellstimationinleucapheresisproducts.BoneMarrowTransplantation,1996;18(4):791

［7］ChangA,DavidDFMA.Theinfluenceofflo