《生物化學》實驗指導(8個實驗)

PAGEPAGE1《生物化學》實驗指導(8個實驗)生物化學實驗指導呂杰編著新疆大學資源與環(huán)境科學學院生態(tài)學教研室

內容介紹《生物化學實驗指導》是新疆大學資源與環(huán)境科學學院《生物化學》課程組的教師在參考國內重點院校、科研院所的生物化學實驗與實習教材的基礎上，結合教師的教學經(jīng)驗匯編而成。該實習指導圍繞教學大綱設計了8個實驗內容。

目目錄實驗一氨基酸紙層析4實驗二DNS-CL法測定N末端氨基酸5實驗三考馬斯亮藍法測定蛋白質的濃度7實驗四酪蛋白的制備8實驗五葡萄糖標準曲線的繪制10實驗六酵母蔗糖酶的提取及活力測定12實驗七酵母RNA的分離及組分鑒定14實驗八維生素C的定量測定16

實驗一一氨基酸紙層析一、實驗目的1、通過氨基酸的紙層析分離，學習紙層析的基本原理和操作方法。

二、實驗原理紙層析：是以濾紙作為支持物的分配層析法，是20世紀40年代發(fā)展起來的一種生化分離技術。由于設備簡單，操作方便，所需樣品量少，分辨力較高等優(yōu)點而廣泛的用于物質的分離，并可進行定性和定量的分析。缺點是展開時間較長。

分配層析法：是利用物質在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達到分離的目的的一種實驗方法。

在一定條件下，一種物質在某種溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一個常數(shù)即=溶質在固定相的濃度/溶質在流動相的濃度。

溶劑系統(tǒng)：由有機溶劑和水組成，水和濾紙纖維素有較強的親和力，因而其擴散作用降低形成固定相，有機溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細管中自由流動，形成流動相，由于混合液中各種氨基酸的分配系數(shù)值不同，其在兩相中的分配數(shù)量及移動速率（即遷移率Rf值）就不同，從而達到分離的目的。

三、實驗材料、儀器和試劑：

1、實驗材料：標準氨基酸溶液2、儀器:層析缸，層析紙，毛細管，天平，吹風機等。

3、、試劑：

（1）氨基酸標準溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸標準溶液。

（2）溶劑系統(tǒng)：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（體積比）搖勻；（3）0.1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮15克，丙酮100毫升四、實驗步驟：

紙層析(1)取一長方形濾紙，在濾紙縱向對應的兩邊距邊沿2cm處，用鉛筆輕輕的各畫兩條平行線，一條作前沿標志，一條作點樣線，在點線上每隔2cm畫一個+作為點樣位置，共5個點。

(2)點樣：用毛細管點樣，其中2個點用毛細管點上氨基酸的標準溶液；中間間隔一點，另2點點上未知氨基酸的溶液。每個點樣點重復點5次，每點一次用電吹風吹干后再點下次，點樣點的直徑應控制在2mm左右，點樣完畢用大頭針將濾紙做成筒形，點樣面向外，注意紙的兩邊不要接觸。

(3)展層：向層析缸中加入層析溶劑，液層不要超過點樣線（高約1.5cm，約50－60ml溶劑），將濾紙點樣點朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達標志線后取出，吹干。

(4)顯色：用噴霧器將茚三酮顯色劑均勻噴在濾紙上，吹風機熱風吹干顯色。

五五.結果分析：

(1)用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點描出來；(2)測量原點至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計算各種氨基酸色譜的Rf值。

Rf=組分移動的距離/溶劑前沿移動的距離=原點至組分斑點中心的距離/原點致溶劑前沿的距離六、思考題：

1、何謂分配層析法和分配系數(shù)？

實驗二二DNS-Cl法測定N末端氨基端一、實驗目的1、學習聚酰胺薄膜層析的方法。

2、學習DNS-Cl測定氨基酸的原理及方法。

二、實驗原理紙層析：是以濾紙作為支持物的分配層析法，是20世紀40年代發(fā)展起來的一種生化分離技術。由于設備簡單，操作方便，所需樣品量少，分辨力較高等優(yōu)點而廣泛的用于物質的分離，并可進行定性和定量的分析。缺點是展開時間較長。

分配層析法：是利用物質在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達到分離的目的的一種實驗方法。

三、實驗材料、儀器和試劑：

1、、實驗器材層析缸毛細管紫外燈烘箱恒溫箱聚酰胺薄膜吹風機2、試劑：

①各種層析純標準氨基酸②DNS-Cl丙酮溶液（稱取25mgDNS-Cl溶于10mL丙酮中，貯于棕色瓶中，至于冰箱保存，一個月內穩(wěn)定）③0.2mol/LNaHCO3溶液④NaOH1M⑤HCl1M⑥展開劑I88%甲酸：水=1.5:100（v/v）⑦展開劑II苯：冰醋酸=9:1（v/v）四、實驗步驟：

1、氨基酸的DNS化分別取0.2-0.3mg的層析純標準氨基酸及樣品氨基酸溶于0.5mL0.2mol/L的NaHCO3溶液中，各取0.1mL于有玻璃塞的試管中，加入0.1mLDNS-CL的丙酮溶液，測pH值，必要時用NaOH調pH至9.0-9.5，于室溫放置2-4h，冷風吹除丙酮后，加HCl調pH2-3水解16-18h，加入乙酸乙酯抽提，分層后取有機相；2、聚酰胺薄膜的準備將聚酰胺薄膜剪成7*7cm的方塊，在距邊0.5cm處畫互為垂直的兩條基線，交叉點為原點，若只做單向層析，則只畫一條基線，在基線上每隔1cm畫一個點樣點。

3、點樣用毛細管取樣，點在點樣點上，點樣點直徑應小于2mm，若多次點樣，點一次吹干一次。

4、展層將點好樣的聚酰胺膜卷成圓筒形，點樣側在筒內，放入層析缸內，槽內加入5-10ml的展開液I進行展開，溶劑到達距頂部0.5cm時，取出膜吹干。

進行雙向層析，第一向層析完畢，取出完全吹干，將膜轉90，用展層液II展開。為了區(qū)分DNS-谷氨酸和DNS-天冬氨酸，DNS-蘇氨酸和DNS-絲氨酸，DNS-丙氨酸和DNS-NH2，可在展開后，吹干，接著用其它展層液在同一方向上展開。

5、DNS-氨基酸的檢測展層結束后，取出薄膜用吹風機吹干，在360nm或者280nm紫外燈下檢測，DNS-氨基酸應呈黃色熒光，用樣品的層析譜與標準的DNS-氨基酸層析譜比較可鑒定樣品氨基酸的種類。

五、結果分析：

(1)用鉛筆將層析熒光點描出來；(2)測量原點至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計算各種氨基酸色譜的Rf值。

Rf=組分移動的距離/溶劑前沿移動的距離=原點至組分斑點中心的距離/原點致溶劑前沿的距離六、思考題：

1、為什么用棉線而不是橡皮筋固定薄膜？

實驗三三考馬斯亮藍染色法定量測定蛋白質一、實驗目的1.掌握考馬斯亮藍染色法定量測定蛋白質的原理與方法2.熟練分光光度計的使用和操作方法二、實驗原理此方法是1976年Bradform建立?？捡R氏亮藍G-250在酸性溶液中為棕紅色，當它與蛋白質結合后，變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與595nm的吸光度成正比。大大提高了測定蛋白質的靈敏度（1ug）三、器材與試劑器材1.可見光分光光度計2.刻度移液管3.移液槍試劑1.0.15M生理鹽水2.考馬斯亮藍試劑(考馬斯亮藍G250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000ml。最終試劑中含有0.01%G250，4.7%乙醇，8.5%磷酸)3.0.1mg/ml蛋白質標準液（結晶牛血清蛋白，預先經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15M生理鹽水配制成0.1mg/ml蛋白溶液。）4.兩種未知濃度的蛋白質溶液。

四、實驗步驟1.標準曲線的制作(1)取試管6支，按下表進行編號并加入試劑。

試劑試管編號1234560.1mg/ml標準蛋白溶液（ml）00.20.40.60.81.00.9%生理鹽水（ml）1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍溶液（ml）333333A595(2)加入3.0ml考馬斯亮藍G250試劑,充分振蕩混合，放置5min后，測定A595值。

(3)分光光度法的基本原理和分光光度計的使用方法(4)A595為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線。

2.未知溶液蛋白質含量的測定(1)未知蛋白質溶液:取實驗室預備的未知蛋白質溶液，各吸取樣品提取液0.1ml，加入考馬斯亮藍G250試劑3.0ml，充分振蕩混合，放置5min后，測A595值(2)根據(jù)A595值，在標準曲線上求出樣品中蛋白含量。

(3)如果所測定的A595值不在標準曲線內，該如何處理？3.結果計算根據(jù)標準曲線求出樣品中蛋白質的含量。

五、復習思考題、作業(yè)題：

1.Bradford法測定蛋白質含量的原理是什么？應如何克服不利因素對測定的影響？2．為什么標準蛋白質必須用凱氏定氮法測定純度？3.根據(jù)蛋白質的呈色反應，測定蛋白質的方法還有哪種？根據(jù)所學知識推斷各種測定方法有何優(yōu)點、缺點

實驗四酪蛋白的制備一、實驗目的1、學習從奶粉中制備酪蛋白的原理和方法。

2、掌握等電點沉淀法提取蛋白質的方法。

二、實驗原理牛乳中的主要的蛋白質是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質的混合物，等電點為4.7。利用等電點時溶解度最低的原理，將牛乳的pH調至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質后便可得到純酪蛋白。

三、材料、試劑與器具（一）材料新鮮牛奶（一）試劑1、95%乙醇1200mL2、無水乙醚1200mL3、0.2mol/LpH4.7醋酸醋酸鈉緩沖液300ml先配A液與B液A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液稱NaAC3H2O54.44g，定容至2000ml。

B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱優(yōu)純醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。

取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸醋酸鈉緩沖液3000ml。

4、乙醇乙醚混合液乙醇：乙醚=1：1（V/V）（二）器具1、離心機2、抽濾裝置3、精密pH試紙或酸度計4、電爐5、燒杯6、溫度計四、操作步驟（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加熱至40℃。在攪拌下慢慢加入預熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖液100mL.用精密pH試紙或酸度計調pH至4.7。

將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘（3000r/min）。棄去清液，得酪蛋白粗制品。

（二）酪蛋白的純化1、用水洗滌沉淀3次，離心10分鐘（3000r/min），棄去上清液。

2、在沉淀中加入30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

3、將沉淀攤開在表面上，風干；得酪蛋白純品。

（三）準確稱重，計算含量和得率。

含量：酪蛋白g/100mL牛乳（g%）

100%測得含量得率:理論含量式中理論含量為3.5g/100mL牛乳。

五、注意事項1、由于本法是應用等電點沉淀法來制備蛋白質，故調節(jié)牛奶液的等電點一定要準確。最好用酸度計測定。

2、精制過程用乙醚是揮發(fā)性、有毒的有機溶劑，最好在通風櫥內操作。

3、目前市面上出售的牛奶是經(jīng)加工的奶制品，不是純凈牛奶，所以計算時應按產(chǎn)品的相應指標計算。

六、實驗報告1、根據(jù)實際操作，以流程圖形式總結酪蛋的制備方法。

2、合理分析實驗所得率七、思考題1、制備高產(chǎn)率純酪蛋白的關鍵是什么？2、試設計另一種提取酪蛋白的方法？

實驗五五葡萄糖標準曲線的繪制一、實驗目的掌握葡萄糖標準曲線的繪制方法，進一步掌握分光光度計的使用。

二、實驗原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。

還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。

HOOCNOOHNO22+還原糖NOOHNH22(DNS)（3－氨基－5－硝基水楊酸）?HOOC三、實驗材料、主要儀器和試劑1．主要儀器（1）玻璃試管：20mL7（2）刻度吸管：

（3）容量瓶：

（4）恒溫水浴鍋（5）沸水?。?）離心機（7）天平（8）分光光度計2．試劑（1）1mg/mL葡萄糖標準液準確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑將6.3gDNS和262mL2mol/LNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。

四、操作步驟1．制作葡萄糖標準曲線

取7支20mL具塞刻度試管編號，按表1分別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應液。

表1葡萄糖標準曲線制作管號1mg/mL葡萄糖標準液（mL）蒸餾水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）O.D.540nm0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2將各管搖勻，在沸水浴中準確加熱5min，取出，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進行比色。調波長540nm，用0號管調零點，測出1~6號管的光密度值。以光密度值為縱坐標，葡萄糖含量（mg）為橫坐標，繪出標準曲線。

五、結果與計算：

用電腦繪出的標準曲線，寫出回歸方程。

六、注意事項1．標準曲線制作時各反應管應同時進行沸水浴加熱，并準確進行定容。

七、思考題1．如何正確繪制和使用標準曲線?

實驗六六酵母蔗糖酶的提取及其性質的研究一、實驗目的本實驗為學生提供一個較全面的實踐機會，學習如何提取純化、分析鑒定一種酶，并對這種酶的性質，尤其是動力學性質作初步的研究。

二、實驗原理至今我們所發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)酶都是蛋白質，因而蛋白質的分離提純方法也適用于酶。對于不同來源的各種酶，通常采用鹽析沉淀、吸附、離子交換、結晶及各種物理化學方法將它提純，在純化過程中，應盡量避免高溫，劇烈的機械攪拌、強酸、強堿等容易造成蛋白質變性的各種激烈條件。

蔗糖酶是一種水解酶，它能使蔗糖水解為果糖和葡萄糖。因此只要用一種適當?shù)脑噭y定反應中還原糖的含量，就可以得知它的活力。蔗糖酶在堿性環(huán)境中非常容易失活，因此可以用堿來終止酶促反應。

實驗中的蔗糖酶活力測定是在35℃下進行活力測定，每三分鐘能使5%蔗糖溶液釋放1毫克還原糖的酶量定為一個活力單位。還原糖的測定是利用3,5-二硝基水楊酸與葡萄糖生成紅色化合物，通過比色法測定還原糖的量即為酶活力。

三、實驗儀器1．試管，2.量筒，3．三角瓶，4．滴管，玻棒，5．分光光度計，溫箱，冰箱，離心機，恒溫水浴，水浴鍋，溫度計。

三、試劑1、1mg/mL葡萄糖標準液準確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2、3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑將6.3gDNS和262mL2mol/LNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。

3、0.lmol/L醋酸緩沖液(pH4.6）：

0.2mol/L醋酸溶液（11.55mL冰醋酸定容至1升），25.5mL與0.2mol/L醋酸鈉溶液（16.4gNaAc或27.2gNaAc3H2O定容至1升）24.5mL混合稀釋到100mL。

4、5%蔗糖溶液（W/V）：5克蔗糖以pH4.6的0.1mol/L醋酸緩沖液溶解，定容至100mL。

5、5mmoL/L的磷酸鈉緩沖液6、0.5mL1mol/L的NaOH四、操作：

1.蔗糖酶粗制品的提取：

取10個g干酵母，加入2.5g硼砂，少許石英砂，逐步加入5mmoL/L的磷酸鈉緩沖液（適當加入），充分研磨30min，然后4000r/min離心15分鐘，記錄上清液總體積，為蔗糖酶的粗制品。

2．葡萄糖濃度測定（l）葡萄糖標準曲線制作取11支試管按下表順序加入1mg/mL葡萄糖液，水及3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS）。

管號1mg/mL葡萄糖標準液（mL）蒸餾水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）O.D.540nm

0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2上述溶液混合均勻后在沸水浴中加熱5分鐘，取出立即用冷水冷卻，以蒸餾水稀釋至25mL，搖勻，測540nm光密度（O.D值）。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，光密度值為縱坐標做出標準曲線。

（2）樣液的測定取四只試管分別加入2mL稀釋的酶液。

1支作對照，加入0.5mL1mol/L的NaOH搖勻，使酶失活。另3支作測定管。

此4支試管和5%蔗糖溶液放在35℃水浴中預熱10分鐘。分別吸取2mL5%蔗糖液于上述四支試管中，并且準確計算時間，3分鐘后在測定管中也加入0.5mL1mol/LNaOH，搖勻（整個反應在35℃下進行）。

管號稀釋酶液（mL）1mol/LNaOH（mL）5%蔗糖（mL）1（對照）20.5（35℃之前）2220.5（3分鐘后立即加入）2320.5（3分鐘后立即加入）2420.5（3分鐘后立即加入）2從反應混合物中吸取0.45mL溶液，用DNS試劑測定酶反應生成的還原糖數(shù)量（方法同標準曲線的制作），反應混合液中加入1.55mL的蒸餾水，再加入1.5mL的DNS。以管1作為對照，管2、3、4為測試管。管2、3、4測定的OD值進行平均，帶入標準曲線的回歸方程，計算出蔗糖酶在35℃下，以5％蔗糖為底物時，3分鐘能釋放出的還原糖的總毫克數(shù)，此數(shù)值即為總活力單位。

實驗七酵母ARNA的分離與組分鑒定一、實驗目的：

學習稀堿法提RNA的原理與技術。

二、實驗原理：

由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實驗室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這2種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡單。濃鹽法是用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取34h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀堿法使用稀堿（本實驗用0.2%NaOH溶液）使酵母細胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA（本實驗）或調pH2.5利用等電點沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。

酵母含RNA達2.6710.0%，而DNA含量僅為0.030.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。

三、器材與試劑：

1．器材：

①干酵母粉（市售）。

②鮮酵母（市售）。

③pH試紙（pH110）。

④臺天平（100g）。

⑤燒杯100mL（1）。

⑥量筒50mL（1）、10mL（1）。

⑦抽濾瓶500mL（1）、布氏漏斗10cm（1）。

⑧吸管0.5mL（1）、1mL（2）、2mL（2）、5mL（1）。

⑨離心機5000r/min。

2．試劑：

①0.2%氫氧化鈉溶液：2gNaOH溶于蒸餾水并稀釋至1000mL。

②乙酸（AR）。

③95%乙醇。

④無水乙醚（CP）。

⑤氨水（CP）。

⑥10%硫酸溶液：濃硫酸（比重1.84）10mL，緩緩傾于水中，稀釋至100mL。

⑦5%硝酸銀溶液：5gAgNO3溶于蒸餾水并稀釋至100mL，貯于棕色瓶中。

⑧苔黑酚三氯化鐵試劑：將100mg苔黑酚溶于100mL濃鹽酸中，再加入100mgFeCl36H2O。臨用時配制。

⑨定磷試劑17％硫酸溶液：將17mL濃硫酸緩緩加入到83mL水中；2.5％鉬酸銨溶液：將2.5g鉬酸銨溶于100mL水中。

10％抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶于100mL水中，貯棕色瓶保存。溶液呈淡黃色時可用，如呈深黃或棕色則失效，需純化抗壞血酸。

臨用時將上述三種溶液與水按如下比例混合。

17％硫酸溶液：2.5％鉬酸銨溶液：10％抗壞血酸溶液：水＝1：1：1：2（V/V）四、操作步驟：

1．RNA的提取：置4g干酵母粉于100mL燒杯中，加入0.2%NaOH溶液40mL，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（石蕊試紙），離心10-15分鐘

（4000r/min）。取上清液（30ml左右），加入95%乙醇30mL，邊加邊攪。加畢，靜置，待完全沉淀，過濾。濾渣先用95%乙醇洗2次（每次約10mL），繼用無水乙醚洗2次（每次10mL），洗滌時可用細玻棒小心攪動沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA，可作鑒定(全部用離心的方法)。

2．鑒定：取上述RNA約0.5g，加10%硫酸液5mL，加熱至沸1-2分鐘，將RNA水解。

（1）取水解液0.5mL，加苔黑酚FeCl3試劑1mL，加熱至沸1分鐘，觀察顏色變化。

（2）水解液2mL，加氨水2mL及5%硝酸銀溶液1mL，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物（有時絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置十幾分鐘）。

（3）磷酸水解液2mL，加入定磷試劑1mL。水浴中加熱，觀察溶液是否變成藍色，說明磷酸是否存在。

五、結果與討論：

1．所得RNA是否是純品？如何進一步純化？2．RNA提取過程中的關鍵步驟及注意事項有哪些？

實驗八八維生素C的定量測定一、實驗目的：

1．學習維生素C定量測定的一般原理；2．掌握用2，6-二氯酚靛酚滴定法定量測定食物和生物體液中維生素C的基本操作技術。

二、實驗原理：

維生素C是人類膳食中必需的維生素之一，如果缺乏維生素C，將導致壞血病發(fā)生。因此，維生素C又稱為抗壞血酸，有防治壞血病的功效?？箟难嵩谧匀唤绶植际謴V泛，存在于新鮮水果和蔬菜中，尤其是檸檬果實和一些綠色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特別豐富。

抗壞血酸的定量測定方法很多，有2，6-二氯酚靛酚（簡稱DCIP）滴定法、碘滴定法、2，4-二硝基苯肼法等。其中廣泛采用的是DCIP滴定法，它具有簡便、快速、比較準確等優(yōu)點，適用于許多不同類型樣品的分析。缺點是不能直接測定樣品中的脫氫抗壞血酸及結合抗壞血酸的含量，易受其他還原物質的干擾。如果樣品中含有色素類物質，將給滴定終點的觀察造成困難。

在酸性環(huán)境中，抗壞血酸（還原型）能將染料2,6-DCIP還原成無色的還原型2,6-DCIP，而抗壞血酸則被氧化成脫氫抗壞血酸。氧化型的2,6-DCIP在中性或堿性溶液中呈藍色，但在酸性溶液中則呈粉紅色。因此，當用2,6-DICP滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時，在抗壞血酸未被全部氧化前，滴下的2,6-DCIP立即被還原成無色，一旦溶液中的抗壞血酸全部被氧化時，則滴下微量過剩的2,6-DCIP便立即使溶液顯示淡粉紅色或微紅色，此時即為滴定終點，表示溶液中的抗壞血酸剛剛全部被氧化。依據(jù)滴定時2,6-DCIP標準溶液的消耗量（mL），可以計算出被測樣品中抗壞血酸的含量。氧化型2,6-DCIP與還原型抗壞血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中進行反應。即先將樣品溶于一定濃度的酸性溶液中或經(jīng)抽提后，再用2,6-DCIP標準溶液滴定至終點。其反應式如下：

本實驗采用2,6-二氯酚靛酚滴定法，以新鮮水果、蔬菜和生物體液為分析材料，進行抗壞血酸含量測定。

三、器材及試劑1．器材：

①市售果汁；②吸管；③容量瓶；④錐形瓶；⑤微量滴定管；⑥天平；⑦抽濾裝置2．試劑：

①2%草酸溶液：草酸2g，溶于100mL蒸餾水。

（2%草酸液可用4%偏磷酸醋酸溶液代替）②1%草酸溶酸：