發(fā)酵工程原理與技術(shù)x neia4a

11第十一章工業(yè)發(fā)酵染菌的防治22本章講述的內(nèi)容第一節(jié)第二節(jié)第三節(jié)第四節(jié)第五節(jié)發(fā)酵染菌的危害發(fā)酵過程中的染菌的判斷發(fā)酵染菌率和染菌原因的分析發(fā)酵染菌的防止噬菌體感染和處理方法第一節(jié)

發(fā)酵染菌的危害

發(fā)酵染菌能給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害，防止雜菌污染是任何發(fā)酵工廠的一項重要工作內(nèi)容。尤其是無菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。

所謂“雜菌”，是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)，都有可能遭受雜菌的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)。3344一，染菌對不同品種發(fā)酵的影響青霉素疫苗檸檬酸谷氨酸肌苷、肌苷酸酶制劑55二，不同種類的雜菌對發(fā)酵的影響

青霉素發(fā)酵：污染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大

鏈霉素發(fā)酵：污染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大

四環(huán)素發(fā)酵：污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大66檸檬酸發(fā)酵：最怕污染青霉菌

肌苷、肌苷酸發(fā)酵：污染芽孢桿菌的危害最大谷氨酸發(fā)酵：最怕污染噬菌體

高溫淀粉酶發(fā)酵：污染芽孢桿菌和噬菌體的危害較大77三，不同染菌時間對發(fā)酵的影響

種子培養(yǎng)期染菌：菌體濃度低、培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富

發(fā)酵前期染菌：雜菌與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成分，干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的形成

發(fā)酵中期染菌：嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的生成

發(fā)酵后期染菌：如雜菌量不大，可繼續(xù)發(fā)酵。如污染嚴(yán)重，可采取措施提前放罐88四，不同染菌途徑對發(fā)酵的影響

種子帶菌：種子帶菌可使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性

空氣帶菌：空氣帶菌也使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性，導(dǎo)致染菌范圍擴(kuò)大至所有發(fā)酵罐

培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底：一般為孤立事件，不具有延續(xù)性

設(shè)備滲漏：這種途徑造成染菌的危害性較大99五，染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響

對過濾的影響：發(fā)酵液的粘度加大菌體大多自溶由于發(fā)酵不徹底，基質(zhì)的殘留濃度增加造成的后果：過濾時間拉長，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞生產(chǎn)平衡大幅度降低過濾收率1010對提取的影響有機(jī)溶劑萃取工藝：染菌的發(fā)酵液含有更多的水溶性蛋白質(zhì)，易發(fā)生乳化，使水相和溶劑相難以分開離子交換工藝：雜菌易粘附在離子交換樹脂表面或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換量1111對產(chǎn)品質(zhì)量的影響對內(nèi)在質(zhì)量的影響：染菌的發(fā)酵液含有較多的蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。對產(chǎn)品的純度有較大影響。對產(chǎn)品外觀的影響：一些染菌的發(fā)酵液經(jīng)處理過濾后得到澄清的發(fā)酵液，放置后會出現(xiàn)混濁，影響產(chǎn)品的外觀。1212六，染菌對三廢處理的影響使過濾后的廢菌體無法利用

發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費(fèi)用和時間1313七，發(fā)酵染菌的危害直接經(jīng)濟(jì)損失間接經(jīng)濟(jì)損失1414第二節(jié)發(fā)酵過程中染菌的檢查判斷一，雜菌的檢查方法目前生產(chǎn)上常用的雜菌檢查方法有：①顯微鏡檢查：染色

鏡檢②平板劃線檢查：到平板

空培養(yǎng)

待測樣品劃線

培養(yǎng)觀察③酚紅肉湯培養(yǎng)檢查：無菌肉湯培養(yǎng)基空培養(yǎng)接入樣品培養(yǎng)觀察1515判斷發(fā)酵是否染菌應(yīng)以無菌試驗結(jié)果為根據(jù)無菌試驗的目的：1，監(jiān)測培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及附屬設(shè)備滅菌是否徹底2，監(jiān)測發(fā)酵過程中是否有雜菌從外界侵入3，了解整個生產(chǎn)過程中是否存在染菌的隱患和死角1616二，各種檢查方法的比較

顯微鏡檢查方法簡便、快速，能及時發(fā)現(xiàn)雜菌，但由于鏡檢取樣少，視野的觀察面也小，因此不易檢出早期雜菌。

平板劃線法和肉湯培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)是需經(jīng)較長時間培養(yǎng)(一般要過夜)才能判斷結(jié)果，且操作較繁瑣，但它要比顯微鏡能檢出更少的雜菌，而且結(jié)果也更為準(zhǔn)確1717三，雜菌檢查中的問題

檢查結(jié)果應(yīng)以平板劃線和肉湯培養(yǎng)結(jié)果為主要根據(jù)平板劃線和肉湯培養(yǎng)應(yīng)做三個平行樣要定期取樣

酚紅肉湯和平板劃線培養(yǎng)樣品應(yīng)保存至放罐后12小時，確定為無菌時方可棄去取樣時防止外界雜菌混入的措施18181919四，檢查的工序和時間

選擇那些生產(chǎn)工序和時間的樣品檢查也是十分重要的問題?？茖W(xué)合理的選擇檢查工序和時間，對于除去已污染雜菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有著直接的指導(dǎo)意義。有時即使由于檢查時間較長，未能及時據(jù)導(dǎo)本批生產(chǎn)，但對于找出造成染菌事故的環(huán)節(jié)，分析染菌原因，杜絕染菌漏洞也是不可缺少的。

由于生產(chǎn)菌種相產(chǎn)品的不同，檢查的時間也不完全一樣：但總的原則是一致的，即每個工序或經(jīng)一定時間都應(yīng)進(jìn)行取樣檢查。2020發(fā)酵過程的雜菌檢查2121除了以上的方法外，在實際生產(chǎn)中還可以根據(jù)以下參數(shù)的異常變化來判斷是否染菌溶解氧pH值尾氣中CO2含量2222第三節(jié)發(fā)酵染菌率和染菌原因的分析一、發(fā)酵染菌率

總?cè)揪剩褐敢荒陜?nèi)發(fā)酵染菌的批次與總投料批次數(shù)之比乘以100得到的百分率

設(shè)備染菌率：統(tǒng)計發(fā)酵罐或其他設(shè)備的染菌率，有利于查找因設(shè)備缺陷而造成的染菌原因

不同品種發(fā)酵的染菌率：統(tǒng)計不同品種發(fā)酵的染菌率，有助于查找不同品種發(fā)酵染菌的原因2323

不同發(fā)酵階段的染菌率：將整個發(fā)酵周期分成前期、中期和后期三個階段，分別統(tǒng)計其染菌率。有助于查找染菌的原因。

季節(jié)染菌率：統(tǒng)計不同季節(jié)的染菌率，可以采取相應(yīng)的措施制服染菌。

操作染菌率：統(tǒng)計操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的滅菌操作技術(shù)水平。2424二、染菌原因的分析

避免在發(fā)酵生產(chǎn)中污染雜菌應(yīng)以預(yù)防為主?！胺乐赜谥巍保虑胺乐箘儆谑潞笸炀?。如果一旦發(fā)生染菌現(xiàn)象就要盡快找出原因及時糾正、堵塞漏洞才能減少損失，并從中吸取經(jīng)驗教訓(xùn)，避免以后有類似情況發(fā)生，保持生產(chǎn)的正常進(jìn)行。但在發(fā)酵生產(chǎn)中，往往因為生產(chǎn)過程的環(huán)節(jié)很多，同時各工廠的生產(chǎn)設(shè)備、產(chǎn)品種類和管理措施不盡相同，引起染菌的原因比較復(fù)雜，有時不能及時找出而耽誤了生產(chǎn)。1，國外一抗生素發(fā)酵染菌原因的分析25染菌原因百分率，%染菌原因百分率，%種子帶菌9.64蛇管穿孔5.89接種時罐壓跌零0.19接種管穿孔0.39培養(yǎng)基滅菌不透0.79閥門泄漏1.45空氣系統(tǒng)帶菌19.96罐蓋漏1.54攪拌軸密封泄漏2.09其他設(shè)備漏10.13泡沫冒頂0.48操作問題10.15夾套穿孔12.36原因不明24.912526262，國內(nèi)一制藥廠發(fā)酵染菌原因的分析35.00原因不明染菌原因百分率，%外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料帶入）8.20設(shè)備穿孔7.60空氣系統(tǒng)帶菌26.00停電罐壓跌零1.60接種11.00蒸汽壓力不夠或蒸汽量不足0.60管理問題7.09操作違反規(guī)程1.60種子帶菌0.6027273，從染菌的規(guī)模來分析染菌原因大批發(fā)酵罐染菌：空氣系統(tǒng)

部分發(fā)酵罐(或罐組)染菌：前期可能是種子帶雜菌，或滅菌不徹底，中后期則可能是中間補(bǔ)料系統(tǒng)或油管路系統(tǒng)發(fā)生問題所造成的

個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備問題(如閥門的滲漏或罐體腐蝕磨損)，設(shè)備的腐蝕磨損所引起的染菌會出現(xiàn)每批發(fā)酵的染菌時間向前推移的現(xiàn)象

個別發(fā)酵罐偶然染菌：原因比較復(fù)雜，因為各種染菌途徑都可能引起。28284，從染菌的時間來分析

發(fā)酵早期染菌：種子帶菌、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底、設(shè)備或管道有死角

中、后期染菌：中間補(bǔ)料、設(shè)備滲漏、操作不合理29295，從染菌的類型來分析耐熱性芽抱桿菌：死角或滅菌不徹底

球菌、酵母：可能是從蒸汽的冷凝水或空氣中帶來的

淺綠色菌落(革蘭氏陰性桿菌)：發(fā)酵罐的冷卻管或夾套滲漏霉菌：滅菌不徹底或無菌操作不嚴(yán)格3030第四節(jié)發(fā)酵染菌的防止一、種子帶菌的原因及防止

1，帶菌的原因無菌室的無菌條件不符合要求培養(yǎng)基滅菌不徹底操作不當(dāng)31312，種子帶菌的防止

種子帶雜菌是發(fā)酵前期染菌的原因之一。在每次接種后應(yīng)留取少量的種子懸浮液進(jìn)行平板、肉湯培養(yǎng)，借以說明是否是種子中帶雜菌。種子培養(yǎng)的設(shè)備和裝置有無菌室、滅菌鍋和搖瓶機(jī)等。3232（1）無菌室無菌室的基本要求：無菌室面積不宜過大，一般約4-6米2高約2.6米。為了減少外界空氣的侵入，無菌室要有1-3個套間(緩沖過道)

無菌室內(nèi)部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無裂縫，墻角最好做成圓弧形。

室內(nèi)布置應(yīng)盡量簡單，最好能安裝空氣調(diào)節(jié)裝置，通入無菌空氣并調(diào)節(jié)室內(nèi)的溫濕度。無菌室的每個套間一般都用紫外線滅菌。3333無菌室立視圖3434化學(xué)滅菌藥劑35

用作噴灑或揩擦的(以揩擦為主)：

75%酒精0.25%新潔而滅(季胺鹽)0.6~1%漂白粉0.5%石炭酸0.5%過氧乙酸1%煤酚皂(來蘇爾)0.5%高錳酸鉀300單位／毫升土霉素50單位／毫升制霉菌素等用作熏蒸的：甲醛(每立方米空間約用10毫升)或硫磺(每立方米空35間約用2-3克)。3636無菌室內(nèi)無菌度的要求

把無菌培養(yǎng)皿平板打開蓋子在無菌室內(nèi)放置

30分鐘，根據(jù)一般工廠的經(jīng)驗，長出的菌落在3個以下為好。3737（2）種子培養(yǎng)基滅菌的注意事項滅菌操作時需要注意排氣管是否暢通固體培養(yǎng)基可采用兩次滅菌的方法

通入蒸汽后使瓶內(nèi)培養(yǎng)基溫度達(dá)到121oC所需的時間與瓶內(nèi)培養(yǎng)基的體積有關(guān)3838（3）種子搖瓶培養(yǎng)的注意事項保證搖瓶間的清潔衛(wèi)生搖瓶內(nèi)液體裝料不宜過多瓶口包扎的紗布一般為八層以上3939二、發(fā)酵設(shè)備、管件的滲漏與配置

設(shè)備和管件的滲漏一般是指設(shè)備和管件由于腐蝕、內(nèi)應(yīng)力或其他原因形成微小漏孔所發(fā)生的滲漏現(xiàn)象。這些漏孔很小，特別是不銹鋼材料形成的漏孔更小，有時肉眼不能直接覺察，需要通過一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn)。40401，設(shè)備滲漏的原因發(fā)酵液中腐蝕性物質(zhì)對設(shè)備的腐蝕磨蝕發(fā)酵液中固體物料因攪拌槳的攪動與冷卻管摩擦而引起管外壁磨損冷卻介質(zhì)和加熱時蒸汽的沖擊，引起管內(nèi)壁的磨損設(shè)備加工不良彎管時，彎頭處管壁變薄焊接不良41412，盤管滲漏的防止放罐后要認(rèn)真清洗發(fā)酵罐控制冷卻水質(zhì)量，降低其中氯離子含量對盤管定期檢查、試漏，及時發(fā)現(xiàn)漏隙試漏方法氣壓試驗：先在發(fā)酵罐內(nèi)放滿清水，用壓縮空氣通入管子，觀察水面有無氣泡產(chǎn)生以確定管子有否滲漏和滲漏的部位。氣壓法快速方便，但管子下部彎曲處積水不易排盡，有漏孔時不產(chǎn)生氣泡就難以發(fā)現(xiàn)。水壓試驗：用手動泵或試壓齒輪泵將水逐漸壓入冷卻管，泵到一定壓力時，觀察管子有否滲漏現(xiàn)象42423，空氣分布管滲漏的防止4，罐體滲漏的防止5，管件的滲漏與發(fā)酵罐相連接的管路很多，有空氣、蒸汽、水、物料、排氣、排污等管路，管路多，相應(yīng)的管件和閥門也多。管道的連接方式、按裝方法以及選用的閥門形式對防止污染有很大的關(guān)系。所以，與發(fā)酵有關(guān)的管路不能同一般化工廠的化工管路完全一樣，而有其特殊的要求。4343(1)閥A，截止閥4444截止閥在使用中經(jīng)常發(fā)生以下兩個問題：

閥心軋壞。物料中的硬質(zhì)物或焊接施工后的焊渣以及螺釘零件等被帶到閥內(nèi)，當(dāng)關(guān)閉時，閥心與閥座被上述堅硬物軋住，能將緊密面軋成凹凸不平的痕跡，就關(guān)不嚴(yán)密。

填料的滲漏。操作時用扳手過分關(guān)緊，會使閥桿彎曲，彎曲后的閥桿不僅啟動費(fèi)力，并且使填料部分不緊密而引起滲漏，操作中需要注意。閥門在使用一定時間后，閥桿磨損或填料損壞也會引起滲漏，就需要將填料壓蓋適當(dāng)擰緊或更換填料。4545截止閥安裝應(yīng)注意的問題方向問題一般發(fā)酵罐附近連接的的各種管道，只有在滅菌通蒸汽時，對關(guān)閉時的閥門，嚴(yán)密度要求較嚴(yán)格，因而在發(fā)酵罐臨近的截止閥按規(guī)定裝置的反方向安裝。打料、接種、加油、加糖等管道上的截止閥，在發(fā)酵過程中還需要滅菌，閥門應(yīng)按正向安裝。46防漏在發(fā)酵罐底的出料閥門和空氣管道連接的蒸汽管道上的閥門，可安裝雙重

閥，其優(yōu)點(diǎn)是：即使閥門1有

漏，蒸汽也可通過閥門3排除464747B，隔膜閥隔膜閥有以下優(yōu)點(diǎn)：嚴(yán)密不漏。無填料。

閥結(jié)構(gòu)為流線型，流量大，阻力小，無死角，無堆積物，在關(guān)閉時不會使緊密面軋壞。

檢修方便。但須定期檢查隔膜有否老化及脫落。4848膜隔閥的缺點(diǎn)：

制造不夠精密；體積較大，在管道上占用較大的面積和空間。中心易引起滲漏。隔膜閥開關(guān)費(fèi)力，需要借助扳手。

橡膠隔膜是橡膠和簾布復(fù)合制成，如質(zhì)量不好，簾布與橡膠易脫落，固定隔膜的螺栓也易脫落。4949

隔膜閥適用于移種、打料管道。這些管道上若裝置截止閥，如滲漏或關(guān)閉不嚴(yán)，易發(fā)生染菌事故。5050閥門試漏的方法（2）管路的連接51

螺紋連接：螺紋連接簡單，但裝拆較麻煩，為了便于裝拆，要在管路上適當(dāng)位置安裝活接頭(亦稱“由寧”)，接頭平面用石棉橡膠板或橡皮等作墊圈。由于管路受冷熱和震動的影響，活接頭的接口易松動，使密封面不能嚴(yán)密而造成滲漏。如在接種輸液時，因液體快速流動造成局部真空，在滲漏處將外界空氣吸入、空氣中的菌就被帶入發(fā)酵罐中而造成危害。所以，重要的管路連接大多采用法蘭連接。法蘭連接：法蘭連接密封可靠，壓力、溫度和管徑的適用范圍大，但費(fèi)用較高。焊接。焊接的方法比其他方法簡便，而且密封可靠。所以空氣滅菌系統(tǒng)、培養(yǎng)液滅菌系統(tǒng)和其他物料管路以焊接連接為好。但需經(jīng)常拆卸的管路則不宜用焊接連接。515252由寧法蘭53536，管路的配置排氣管與下水管發(fā)酵廠中若干發(fā)酵罐的排氣管路大多匯集在一條總的管路上，以節(jié)約管材，下水管亦然。但在使用中有相互串通，相互干擾的弊病，一只罐染菌往往會影響其他罐。排氣管路的串通連接尤其不利于污染的防止。故對于排氣和下水管路要考慮發(fā)酵的特點(diǎn)進(jìn)行配置，對于容易染菌的場合還是以每臺發(fā)酵罐具有獨(dú)立的排氣、下水管路為宜。倘若使用一根總的排氣管時，必須選擇較大直徑的管子，保證排氣下水通暢不致倒回到發(fā)酵罐內(nèi)。5454（2）發(fā)酵罐的管路由于罐體和有關(guān)管路均需用蒸汽進(jìn)行滅菌，所以要保證蒸汽能夠達(dá)到所有需要滅菌的地區(qū)，對于某些蒸汽可能達(dá)不到的死角(如閥)要裝設(shè)與大氣相通的旁路(圖中的小閥門)。在滅菌操作時，將旁路閥門打開，使蒸汽自由通過。接種、取樣和加油等管路要配置單獨(dú)的滅菌系統(tǒng)，使能在發(fā)酵罐滅菌后或在發(fā)酵過程中單獨(dú)進(jìn)行滅菌。5555三、發(fā)酵罐與管件的死角

所謂死角是指滅菌時因某些原因使滅菌溫度達(dá)不到或不易達(dá)到的局部地區(qū)。發(fā)酵罐及其管路如有死角存在，則死角內(nèi)潛伏的雜菌不易殺死，會造成連續(xù)染

菌，影響生產(chǎn)的正常進(jìn)行。56561，法蘭連接的死角發(fā)酵工廠的有關(guān)管路要保持光滑、通暢、密封性好，以避免和減少管道染菌的機(jī)會。例如法蘭與管子焊接時受熱不勻使法蘭翹曲密封面發(fā)生凹凸不平現(xiàn)象就會造成死角(圖7-8c)。墊片的內(nèi)圓比法蘭內(nèi)徑大或比較小以及安裝時沒有對準(zhǔn)中心也會造成死角

(圖7-8a、b)。57572，渣滓在罐底與用環(huán)式空氣分布管所形成的死角58583，不銹鋼襯里的死角59594，接種管路的死角

采用種子罐時是利用壓力差將種子罐中培養(yǎng)好的種子輸入發(fā)酵罐內(nèi)，種子罐與發(fā)酵罐的一段連接管路的滅菌是與發(fā)酵罐的滅菌同時進(jìn)行的。如下圖所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以應(yīng)在閥

1的半截上裝設(shè)旁通，焊上一個小的放氣閥，此段管路即可得到蒸汽的充分滅菌。60605，排氣管的死角

罐頂排氣管彎頭處如有堆積物，其中窩藏的雜菌不容易徹底消滅，而當(dāng)發(fā)酵時受攪拌的震動和排氣的沖擊就會一點(diǎn)點(diǎn)地剝落下來造成污染。另外排氣管的直徑太大，滅菌時蒸汽流速小也會使管中部分耐熱菌不能全部殺死。所以排氣管要與罐的尺寸有一定比例，不宜過大或過小。61616，不合理補(bǔ)料管配置造成的死角62627，壓力表安裝不合理形成的死角6363四、染菌后的挽救措施種子培養(yǎng)或種子罐中發(fā)現(xiàn)污染。

發(fā)酵早期染菌可以適當(dāng)添加營養(yǎng)物質(zhì)，重新滅菌后再接種發(fā)酵。

中后期染菌，如果雜菌的生長將影響發(fā)酵的正常進(jìn)行或影響產(chǎn)物的提取時，應(yīng)該提早放罐。

有些發(fā)酵染菌后發(fā)酵液中的碳、氮源還較多，如果提早放罐，這些物質(zhì)會影響后處理提取使產(chǎn)品取不出，此時應(yīng)先設(shè)法使碳、氮源消耗，再放罐提取。6464

有時發(fā)酵罐偶而染菌，原因一時又找不出，一般