姜黃素對秀麗隱桿線蟲降脂及抗氧化作用

姜黃素對秀麗隱桿線蟲降脂及抗氧化作用

胖是由外部環(huán)境因素或人體因素引起的常見疾病，包括代謝綜合征、冠狀動脈粥樣硬化和高血壓。減肥降脂相關功能食品的研發(fā)是未來的發(fā)展方向之一,姜黃素是從姜科植物姜黃(CurcumaIongaL.)中提取出來的一種橙黃色酚類物質(zhì),是中藥姜黃的主要活性成分,其分子式是C秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)為低等的無脊椎動物,其長度為1mm,身體透明,以大腸桿菌OP50為食,其繁殖能力強,野生型線蟲分為幼蟲期(L因此本文以秀麗隱桿線蟲為動物模型,油紅O染色線蟲腸道脂肪,檢測線蟲體內(nèi)甘油三酯的含量變化,同時測定線蟲體內(nèi)總超氧化物歧化酶活力(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量的變化,確定姜黃素對線蟲腸道脂肪、甘油三酯含量及抗氧化作用的影響。1材料和方法1.1試劑與儀器大腸桿菌OP50與秀麗隱桿線蟲N2野生型中國科學院生物物理研究所;姜黃素(純度:98.9%)中國食品藥品檢定研究院;油紅O(純度≥75.0%)Sigma-Aldrich公司;二甲基亞砜(DMSO純度:99.0%)北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;曲拉通X-100(TritonX-100)Sigma-Aldrich公司;甘油三酯試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量測定試劑盒北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司等。注射器式濾器美國PALL公司;S6E連續(xù)變倍體視顯微鏡德國Leica公司;TL2010S中通量組織研磨儀北京鼎昊源科技有限公司;MJ-250F-II霉菌生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;UV-2000紫外-可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司等。1.2實驗方法1.2.1培養(yǎng)格蘭外纖維參考何露取以上姜黃素菌液和DMSO菌液涂布線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)平板,每個加藥濃度菌液分別各涂布1個NGM培養(yǎng)基平板,20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h待用(供線蟲腸道脂肪染色使用)。取以上姜黃素菌液和DMSO菌液涂布NGM培養(yǎng)基平板,每個加藥濃度菌液分別各涂布4個NGM培養(yǎng)基平板,20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h待用(供甘油三酯測定使用)。取以上姜黃素菌液、DMSO菌液和V1.2.2線蟲連接和生長將同步化后培養(yǎng)14h的L1.2.3染料紅o用量的確定油紅O染色劑:油紅O染色線蟲腸道脂肪,常規(guī)染色方法中油紅O難溶于水,酒精配制后容易造成線蟲體內(nèi)脂肪的溶解,且隨著酒精的揮發(fā),染料使用過程中極易形成結晶每個濃度組取1個培養(yǎng)至L1.2.4多元醇含量檢測每個濃度組取6個培養(yǎng)至L1.2.5線程t-sod酶活性和mda含量的測定每個濃度組取6個培養(yǎng)至L1.2.6線蟲腸道脂肪熒光密度研究以Image-ProPlus6.0軟件分析被染色線蟲圖像并測量線蟲腸道脂肪紅光密度,用SPSS20.0軟件中ANOVA分析方法比較不同組間線蟲腸道脂肪含量、甘油三酯含量、T-SOD酶活力及MDA含量,用OriginPro9.1軟件作圖。2結果與分析2.1線蟲腸道脂肪紅光密度檢測如圖1所示,油紅O將線蟲腸道脂肪染為紅色,顏色鮮艷并且容易觀察,染色效果良好,而未染色線蟲呈透明狀。如圖2所示,姜黃素處理線蟲48h后,分析線蟲腸道脂肪含量顯示,12.5μmol/L姜黃素處理組與DMSO對照組無差異(p>0.05),25μmol/L姜黃素處理組與DMSO對照組相比腸道脂肪含量顯著降低(p<0.05),50和100μmol/L姜黃素處理組與DMSO對照組相比腸道脂肪含量極顯著降低(p<0.01)。25和50μmol/L姜黃素處理組與12.5μmol/L姜黃素處理組相比有顯著差異(p<0.05),100μmol/L姜黃素處理組與12.5μmol/L姜黃素處理組相比有極顯著差異(p<0.01)。且隨著姜黃素濃度升高,線蟲腸道脂肪紅光光密度逐漸減弱。提示姜黃素濃度在25μmol/L以上具有降低線蟲腸道脂肪作用,50~100μmol/L姜黃素可以極顯著(p<0.01)降低腸道脂肪。2.2dmso和0和100mol/l姜黃素處理組與dmso對照組的比較圖3顯示,12.5μmol/L姜黃素處理組與DMSO對照組相比線蟲體內(nèi)甘油三酯含量無顯著差異(p>0.05),25、50和100μmol/L姜黃素處理組與DMSO對照組相比有極顯著差異(p<0.01),25、50和100μmol/L姜黃素處理組與12.5μmol/L姜黃素處理組相比有極顯著差異(p<0.01),25、50和100μmol/L姜黃素處理組之間無顯著差異(p>0.05)。提示姜黃素濃度在25μmol/L以上時能夠極顯著(p<0.01)降低線蟲體內(nèi)甘油三酯的含量。2.3姜黃素處理對美麗隱桿線蟲t-sod酶活力的影響SOD是機體重要的抗氧化酶,負責清除機體超氧陰離子自由基,起到抗氧化保護作用2.4姜黃素處理對美麗隱桿線蟲中sda含量的影響MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物,常用于評價機體脂質(zhì)過氧化程度和氧化受損傷程度,MDA的含量越大則說明機體氧化損傷越嚴重3油紅o染色線蟲圖像分析首先本實驗選擇油紅O對線蟲脂肪進行染色,在顯微鏡下可以直觀地觀察到脂肪積累情況。油紅O為油溶性染料,染色中性脂肪,即染色線蟲中甘油三酯,在倒置顯微鏡普通光條件下即可清晰觀察線蟲腸道脂肪染色情況。但實驗發(fā)現(xiàn),油紅O染色過程中只加入油紅O染色效果不是十分明顯,且有部分蟲體沒有染色,分析可能原因為油紅O未能充分進入線蟲腸道脂肪。TritonX-100是一種非離子型表面活性劑,其能有效增加抗體對細胞膜的通透性,因此本實驗將油紅O工作液與TritonX-100溶液以5∶3的比例配制為油紅O染色劑,染色效果良好。Image-ProPlus6.0分析油紅O染色線蟲圖像,顯示姜黃素濃度在25μmol/L以上具有明顯降低線蟲腸道脂肪作用,50~100μmol/L降低腸道脂肪作用極顯著。其次甘油三酯水解為甘油和不飽和脂肪酸,故本實驗測定姜黃素作用于線蟲72h后甘油三酯和甘油含量變化,結果顯示姜黃素濃度在25μmol/L以上極顯著降低線蟲體內(nèi)甘油三酯含量,姜黃素濃度在25μmol/L以上極顯著增加線蟲體內(nèi)甘油含量。綜上所述,姜黃素濃度在25μmol/L以上顯著降低線蟲體內(nèi)脂肪沉積,促進甘油三酯的分解代謝,增加甘油三酯的分解,提高代謝產(chǎn)物甘油的含量。胡忠澤此外,正常情況下生物體內(nèi)活性氧和活性氮的產(chǎn)生與清除保持著動態(tài)平衡,其中活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)主要包括超氧陰離子自由基(O4姜黃素對線蟲腸道脂肪的抗氧化作用本研究通過測定油紅O染色線蟲腸道脂肪紅光密度值變化和線蟲體內(nèi)甘油三酯含量變化來確定姜黃素對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的影響。姜黃素濃度在25μmol/L以上具有顯著降低線蟲腸道脂肪的作用,50μmol