單克隆抗體技術(shù)

單克隆抗體技術(shù)匯報(bào)人：陳海云吳亞榮指導(dǎo)老師：余為一主要內(nèi)容： 一、概念 二、單克隆抗體的原理 三、單克隆抗體的制備 四、單克隆抗體的應(yīng)用

1975年Kohler&Milstein創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)，獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)創(chuàng)立者：一、概念多克隆抗體（PcAb）：病原微生物和天然抗原含有多種抗原決定簇，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)后，可形成針對不同抗原決定簇的混合抗體。單克隆抗體（mAb)：單個(gè)淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生，針對一種特定抗原決定簇的抗體。

單抗和多抗產(chǎn)生區(qū)別小鼠多克隆抗體（PcAb）與單克隆抗休（McAb）的比較項(xiàng)目PcAbMcAb抗體的制備用免疫血清用雜交瘤技術(shù)抗體的濃度0.1-1.0mg/ml（血清）10-100μg/ml(培養(yǎng)上清)1-10mg/ml（血清）5-20mg/ml（腹水）均一性抗體組成復(fù)雜抗體組成單一特異性抗體批間有差異抗體批間無差異識(shí)別的抗原決定簇多單一二、基本原理三、制備流程：材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

與骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系的動(dòng)物（BALB/c小鼠6-8周齡20-25g）

抗原：可溶性抗原或顆粒性抗原B淋巴細(xì)胞：小鼠脾臟骨髓瘤細(xì)胞：與實(shí)驗(yàn)小鼠同一品系的動(dòng)物細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)。常用骨髓瘤細(xì)胞SP2/0、NS1等。材料準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其他活細(xì)胞則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的細(xì)胞稱飼養(yǎng)細(xì)胞。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟細(xì)胞、胸腺細(xì)胞。作用營養(yǎng)作用

清潔作用細(xì)胞融合方法骨髓瘤細(xì)胞B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞-B細(xì)胞B細(xì)胞-B細(xì)胞B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合篩選雜交瘤細(xì)胞方法：電融合激光融合離心融合滅活的病毒融合聚乙二醇融合法脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例為3:1或5:1,最為常用。大概1-2周后，小鼠腹部會(huì)膨脹，抽取小鼠腹水，可獲得大量單克隆抗體。體內(nèi)培養(yǎng)法體外培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞碎片，可獲得單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞的篩選1雜交瘤細(xì)胞的篩選2單克隆抗體的應(yīng)用篩選原理在實(shí)際免疫過程中，一種抗原決定簇只能刺激機(jī)體形成相對應(yīng)的一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對某一預(yù)定抗原快定簇的特異性雜交瘤細(xì)胞。第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞DNA合成途徑1.主要途徑：氨基酸鳥嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸

2.替代途徑：次黃嘌呤（H）HGPRT酶3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）TK酶HAT選擇培養(yǎng)基的組分次黃嘌呤（hypoxanthine,H)胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)氨甲喋呤（aminopterin,A):葉酸拮抗劑，是細(xì)胞合成DNA的阻斷劑。

正常B細(xì)胞利用HAT培養(yǎng)液中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，在

次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGRPT）和胸腺嘧啶激酶

(TK)的催化下經(jīng)旁路合成DNA。

骨髓瘤細(xì)胞是遺傳基因缺陷型的細(xì)胞系，缺乏HGRPT或TK。HGRPT酶TK酶雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞生長情況融合后3~4天后，可見外形似骨髓瘤細(xì)胞，渾圓透亮的克隆。融合后第7~9天取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體四、抗體的檢測篩選：免疫酶技術(shù)——間接ELISA免疫熒光技術(shù)ELISA原理將抗原包被于酶標(biāo)板，與待檢雜交瘤細(xì)胞上清液反應(yīng)，如該上清液中含有特異性的抗體（一抗Ab），即可與酶標(biāo)二抗作用，加底物經(jīng)酶催化呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，通過檢測OD值判定結(jié)果。雜交瘤細(xì)胞的克隆化目的：建立單一細(xì)胞的克隆方法：有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽性孔計(jì)數(shù)0.1ml/孔單克隆抗體的應(yīng)用醫(yī)學(xué)上用作診斷試劑1鑒別淋巴細(xì)胞2鑒別病原體，診斷傳染病3腫瘤的診斷和分型4激素類單抗用于判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)單克隆抗體的應(yīng)用用作研究工具1.純化抗原2.