倍半稀釋法測定10-hda對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

倍半稀釋法測定10-hda對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

10-羥色胺-2-戈齊酸（10-hydro-2-acid），簡稱10-hda。這是人體中的重要脂肪酸。約50%的天然脂肪體在天然漿中含量約為1.4%2.0%。關于抗菌物質的抑菌機理報道很多,一般認為抑菌劑的主要作用途徑是膜攻擊、抑制細胞呼吸或者抑制蛋白質的合成等1材料和方法1.1其他試劑的制備金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)為本實驗室保藏菌種,其他試劑均為分析純。DDS-11A電導率儀,上海第二分析儀器廠;紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;DYY-12電泳儀,北京市六一儀器廠;ChampGel5500凝膠成像系統(tǒng),北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;原子力顯微鏡,德國Bruker公司。1.2測試方法1.2.1菌種培養(yǎng)及培養(yǎng)配制LB液體培養(yǎng)基經121℃滅菌20min后,冷卻,接種金黃色葡萄球菌后于37℃、180r/min條件下培養(yǎng)24h。取菌液進行平板劃線培養(yǎng),挑取生長狀況較好的單個菌落進行液體培養(yǎng)基擴培。1.2.2lfoxide,dmso液體倍半稀釋法:用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,即DMSO)配制10-HDA倍比稀釋液,同時設置無菌水對照組和溶劑對照組(即DMSO對照組)。取對數生長期的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液稀釋至1×101.2.3-hda的體外生長取活化后的金黃色葡萄球菌菌種按1%(v/v)接種量分別接種于4個100mLLB培養(yǎng)基中,分別加入等體積的不同濃度的10-HDA,使其終濃度分別為0×MIC(即DMSO對照組)、1×MIC、3×MIC,同時設置無菌水空白對照組,于37℃、180r/min培養(yǎng),不同時間點取樣測OD1.2.4菌株4的離心測定將培養(yǎng)至對數生長期的金黃色葡萄球菌于5000r/min離心10min,收集菌體。然后用滅菌生理鹽水洗滌,重復操作兩次,然后用生理鹽水調節(jié)菌體濃度至101.2.5影響細菌物質含碳量的體積在濃度為101.2.6影響細胞的微結構特征的影響取制備的濃度為101.2.7影響細菌代謝活力的因素取制備的濃度為101.2.8添加dmso后體外生長曲線金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數生長期,按5%(v/v)接種量分別接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中,分為對照組和試驗組,試驗組加入10-HDA溶液分別使其終濃度為1×MIC、3×MIC,同時設置對照組,加入等體積的DMSO溶劑,繼續(xù)于37℃、150r/min培養(yǎng),分別于8h后取樣,稀釋成相同的吸光度值后取樣10mL于5000r/min離心10min。然后用生理鹽水洗滌2次,取沉淀加20μL無菌水和20μL上樣緩沖液于100℃保溫5min,再次離心,取10μL上清液進行SDS凝膠電泳。2結果與分析2.1mic測試結果由表1結果可知,10-HDA對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯,最小抑制質量濃度為0.062mg/mL。2.2對細菌生長曲線的影響菌液的光密度值(OD值)可以用來衡量菌液中細菌數目的多少,因此,OD值的變化可以間接的反應10-HDA對金黃色葡萄球菌生長的影響情況。10-HDA對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響見圖1。由圖1結果可知,無菌水對照組和0×MIC試驗組(即DMSO對照組)的菌體生長狀態(tài)幾乎無差別,因此可以忽略10-HDA的溶劑(DMSO)對金黃色葡萄球菌的生長的影響。加入10-HDA的試驗組與對照組相比,菌液的光密度值明顯降低,表明10-HDA對金黃色葡萄球菌的生長有較好的抑制作用,且隨著加入的10-HDA濃度由1×MIC增加到3×MIC,OD2.3對菌體膜滲透率的影響在正常情況下,細菌的細胞膜具有一定的半透性及流動性。當細菌不利生長條件或者抑菌劑作用時,細菌細胞膜會遭到破壞,喪失其半透性并流動性降低,進而菌體的保護屏障被打破,內部的電解質(如K圖2反映了金黃色葡萄球菌經10-HDA處理后其菌液電導率的變化情況。由圖2可知,無菌水對照組和0×MIC試驗組(即為溶劑對照組)的菌液電導率變化不大,因此可以忽略溶劑二甲基亞砜對金黃色葡萄球菌的細胞膜滲透性的影響。而當菌液在1×MIC濃度的10-HDA處理后,菌液的電導率明顯高于對照組,這說明了在1×MIC濃度的10-HDA使細胞膜遭到破壞,導致細菌細胞膜流動性降低,通透性增大,從而大量電解質外滲。隨著作用時間的延續(xù),菌液的電導率也相應增加,菌體電解質的外泄程度進一步提高,說明菌體細胞內環(huán)境和細胞膜穩(wěn)定性已受到破壞,金黃色葡萄球菌的生長受到抑制。3×MIC的10-HDA對菌體的作用效果更加明顯,進一步說明了10-HDA濃度與其對菌體細胞的作用效果正相關。2.4操作膜不透過受膜過氧化細菌的細胞膜是細菌的保護屏障。當菌體細胞通透性屏障受損或其核心受到破壞,使得在正常狀態(tài)下不能透過細胞膜的具有紫外吸收的大分子物質(如DNA、RNA等)通過細胞膜泄漏到菌懸液中,進而導致菌懸液在260nm處的吸光度值增大2.5對細菌細胞的形態(tài)測量原子力顯微鏡(AFM)是目前研究生物醫(yī)學樣品和生物大分子的必要研究工具。將加入10-HDA的金黃色葡萄球菌菌懸液,以及空白對照組的金黃色葡萄球菌菌懸液在37℃恒溫搖床中培養(yǎng)5h后,用AFM觀察金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)。金黃色葡萄球菌的2D效果圖,分別如圖A-1,圖B-1所示,3D效果圖分別如圖A-2,圖B-2所示。從圖A-1空白對照組金黃色葡萄球菌的二維形態(tài)圖中可以看出,空白對照組的金黃色葡萄球菌菌體成近乎圓形,細胞大小均一,對其中一個細胞的大小進行測量,其長度約為1.04μm;從圖A-2空白對照組的三維形態(tài)圖中可以看出,空白對照組的金黃色葡萄球菌細胞飽滿,表面光滑。從圖B-1和圖B-2中可以看出,10-HDA處理金黃色葡萄球菌5h之后,金黃色葡萄球菌細胞表面有褶皺,菌體有凹陷,對其中一個細胞的大小進行測量,長度約為0.87μm,細胞大小明顯縮小。試驗結果說明,10-HDA能夠破壞金黃色葡萄球菌的正常形態(tài),使細胞大小縮小并且表面形成褶皺。其原因可能是由于細胞內容物的大量外泄使得菌體細胞壁凹陷,形成褶皺。2.6活化氫離子檢測10-HDA對金黃色葡萄球菌代謝活力的影響結果見圖5。活細胞在脫氫酶的作用下生成一種活化氫離子,該離子可以將氯化碘硝基四唑紫還原成穩(wěn)定的甲瓚,因此可以利用甲瓚生成的速率來推測細胞的代謝活力2.7電泳條帶的變化由圖6可知,正常金黃色葡萄球菌蛋白的SDS電泳譜帶與10-HDA作用下的金黃色葡萄球菌蛋白電泳條帶相比,呈現明顯差別。10-HDA作用后,蛋白電泳條帶明顯變淺,有些條帶甚至消失,抑制了部分蛋白的正常表達。并且,隨著10-HDA濃度的增大,蛋白電泳條帶的變化更加明顯。為精確10-HDA處理前后金黃色葡萄球菌蛋白含量的變化,我們采用蛋白分析軟件Gel-Proanalyzer對金黃色葡萄球菌的蛋白電泳圖譜中比較明顯的條帶進行分析。分析結果如表2所示。從表2的蛋白含量分析結果來看,經10-HDA作用后的金黃色葡萄球菌蛋白含量明顯降低,包括r7,r8,r11。此外,10-HDA使得金黃色葡萄球菌中r5條帶消失。說明,10-HDA對金黃色葡萄球菌的蛋白表達有一定程度的影響。3對細菌的抑菌機理本文通過倍比稀釋法確定10-HDA對金黃色葡萄球菌的最小抑菌質量濃度為0.062mg/mL,同時,進一步研究了10-HDA對金黃色葡萄球菌的抑菌機