仿刺參成參體腔細胞酚氧化酶的生化與酶學特性

仿刺參成參體腔細胞酚氧化酶的生化與酶學特性

作為無脊椎動物先天性免疫系統(tǒng)中的一個重要免疫成分，酚類物質(zhì)通常不具有殺菌和抗菌作用，但可以通過轉(zhuǎn)化苯酚類物質(zhì)生成類，然后通過一系列非酶抑制劑最終形成黑色素。酚氧化酶免疫功能的發(fā)揮與其自身的生化和酶學特性密切相關(guān)仿刺參(已有的研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參幼參體腔液中含有3種酚氧化酶筆者自仿刺參成參體腔細胞中分離純化出4種酚氧化酶，對4種酚氧化酶的耐熱性、最適pH、底物特異性、反應動力學參數(shù)、二價金屬離子和抑制劑對酶活性的影響方面進行研究，為進一步查明仿刺參成參酚氧化酶系統(tǒng)的特性和功能機制、探索酚氧化酶系統(tǒng)在仿刺參中的免疫和生理功能提供基礎支持。1材料和方法1.1生殖期不同的排精排精排精體質(zhì)量(236±5)g仿刺參雌、雄各30頭，在仿刺參產(chǎn)卵時，根據(jù)排精排卵來判斷雌雄，并將雌、雄仿刺參分別于試驗室暫養(yǎng)(水溫15～18℃,pH8.1～8.3,鹽度31)7d。樣品均取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院海水養(yǎng)殖引育種中心。1.2體腔細胞破碎液的制備用剪刀分別將雌、雄仿刺參從腹部劃開，收集仿刺參體腔液，分別進行離心(4℃,6000r/min,10min),棄上清液，將雌、雄仿刺參的體腔細胞分別充分混勻后，加入磷酸緩沖液，經(jīng)超聲波破碎后再次進行離心(4℃,14000r/min,25min),取體腔細胞破碎上清液，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?.3采用超酚氧化酶法進行分離和精制采用鄰苯二酚發(fā)色法結(jié)合線性連續(xù)梯度非變性電泳的方法來分離雌、雄仿刺參體腔細胞破碎液中的酚氧化酶采用多巴絡合物生成法=式中，1.4酚氧化酶活性的測定用濃度15mmol/L的左旋多巴溶于pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液中，通過向1.5mol/L的Tris溶液中滴加濃鹽酸的方法來調(diào)節(jié)緩沖液的pH,100μL純化后的酚氧化酶溶液與2.0mL不同pH的左旋多巴溶液混勻后，采用分光光度法在490nm波長下測定吸光度值，分別代入標準曲線計算各組酚氧化酶活性。將4種酚氧化酶分別在沸水中加熱5、10、20、30min,以20mmol/L多巴胺為底物與加熱后4種酚氧化酶混合，采用分光光度法在490nm波長下測定吸光度值，分別代入標準曲線計算各組酚氧化酶活性。1.5二價金屬離子對酶活性的影響選用Ca1.6添加劑對酶活性的影響選取抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、二乙基二硫代氨基甲酸鈉作為酚氧化酶的抑制劑，超純水作為空白對照，并參照文獻1.7實體特異性選用鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對苯二酚作為不同底物，對照組用等體積的Tris-HCl緩沖液(pH7),參照文獻1.8數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析及Duncan多重比較，獲得不同抑制劑對酶活性作用的差異性，2結(jié)果2.1現(xiàn)白色圖1非變性電泳后，經(jīng)鄰苯二酚發(fā)色，共發(fā)現(xiàn)4條酚氧化酶條帶，均呈現(xiàn)褐色(圖1a)。為區(qū)別于仿刺參幼參體內(nèi)的3種酚氧化酶，將這4種酚氧化酶按分子質(zhì)量由高到低分別命名為AjPO4、AjPO5、AjPO6、AjPO7,與右側(cè)(圖1b)Jiang等2.2ph和溫度對酚氧化酶活性的影響測定的pH為2.0～10.0,使用多巴胺作為底物，仿刺參中AjPO4和AjPO6在pH為9.0時具有最高活性，AjPO5和AjPO7在pH為8.0時具有最高活性；當pH高于9.0時，4種酚氧化酶的活性隨pH的升高而降低(圖2)。仿刺參酚氧化酶的耐熱性試驗顯示，AjPO4、AjPO5、AjPO6在沸水中的時長對酶活性基本無太大的影響，耐熱性較好；AjPO7在沸水中的時長超過20min時酶活性急劇下降，耐熱能力較其他3種弱一些(圖3)。2.3二價金屬離子對酚氧化酶活性的影響Mn2.4乙二胺四乙酸二鈉在仿刺參中，亞硫酸鈉、抗壞血酸、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、檸檬酸對酚氧化酶均有一定的抑制作用，乙二胺四乙酸二鈉對AjPO6和AjPO7有輕微抑制作用，對AjPO4、AjPO5無抑制作用。其中AjPO4、AjPO6和AjPO7受檸檬酸抑制最顯著，AjPO7受二乙基二硫代氨基甲酸鈉抑制較明顯(圖5)。亞硫酸鈉對4種酚氧化酶活性均有一定的抑制作用。2.5酚葡萄酸的性質(zhì)和動力學參數(shù)使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算得出(圖6),AjPO4對鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對苯二酚的米氏常數(shù)3討論3.1采用超刺酚酶法進行分離和精制已有的研究發(fā)現(xiàn)，在仿刺參成參體腔細胞內(nèi)存在3種不同于仿刺參幼參的酚氧化酶，其中雌性3種，雄性2種3.2酚葡萄酸的性質(zhì)這4種酚氧化酶的分子質(zhì)量在其他物種中已發(fā)現(xiàn)的酚氧化酶中屬于分子質(zhì)量較大的。自亞洲玉米螟(3.3酚氧化酶的變化通過分析仿刺參酚氧化酶耐熱性的試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AjPO4、AjPO5、AjPO63種酚氧化酶在沸水中的時長對酶活性無明顯影響，可以看出仿刺參酚氧化酶具有很好的耐熱性，這與大多數(shù)海洋無脊椎動物酚氧化酶特征相同；而AjPO7在沸水中超過20min活性開始急劇下降，AjPO7是雌性仿刺參特有的一種酚氧化酶，其他3種酚氧化酶是雌、雄仿刺參共有。關(guān)于AjPO7與其他3種酚氧化酶的耐熱性差異能否對雌、雄仿刺參的耐熱性產(chǎn)生影響，還需進一步研究。3.4二價金屬離子對酚氧化酶活性的影響近年，有關(guān)在某些水產(chǎn)養(yǎng)殖動物人工配合飼料中添加金屬離子的報道較多。李荷芳等3.5抑制劑抑制劑的用量二乙基二硫代氨基甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和亞硫酸鈉均有較明顯的抑制雌、雄仿刺參4種酚氧化酶活性的作用。其中，二乙基二硫代氨基甲酸鈉是特異性的銅離子螯合劑，表明本試驗中的雌、雄仿刺參4種酚氧化酶含銅3.6ajpo7的特異性AjPO7作為雌性仿刺參特有的1種酚氧化酶，與其他3種酚氧化酶相比，在耐熱性以及受二價金屬離子影響方面均有其特殊性，AjPO7的這種生化特性可為仿刺參雌雄鑒別技術(shù)研究提供基礎數(shù)據(jù)支持。仿刺參這4種酚氧化酶生化與酶學特性的研究，有助于進一步了解仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)的特性和功能，并為刺參免疫增強劑的開發(fā)提供科學指導。4種酚氧化酶的復配本試驗在仿刺參成參體腔細胞中分離純化出4種酚