dehp對(duì)子代大鼠神經(jīng)行為的影響

dehp對(duì)子代大鼠神經(jīng)行為的影響

塑化劑dep的中文名字叫二苯二甲酸二酯（2-乙基），也被稱為二苯二甲酸二異丙酯。它是二甲苯二甲酯（pae）的重要成員。廣泛應(yīng)用于食品材料、容器、醫(yī)療用品和人類疾病的加工應(yīng)用。作為原料，它也可以用作香劑和沐浴精。這是一種廣泛用于工業(yè)的增塑劑。世界年產(chǎn)量可達(dá)300-400萬(wàn)噸。由于DEHP是脂溶性的,不以共價(jià)鍵結(jié)合于PVC分子上,因此,隨著使用時(shí)間的推移,可不斷地從膜中釋出,揮發(fā)至大氣、土壤和水域中,造成對(duì)環(huán)境、生物、食品的污染。世界衛(wèi)生組織、美國(guó)食品與藥品監(jiān)管局和歐盟分別認(rèn)為,對(duì)于60kg體重的人來(lái)講,每天攝入1.2、2.4和3.0mg的DEHP是安全的。但是,隨著DEHP產(chǎn)量的逐年增加,其在環(huán)境中的濃度也逐年升高,對(duì)人體的毒性作用也越來(lái)越受到關(guān)注。尤其2011年5月24日以來(lái),發(fā)生的“塑化劑”事件對(duì)于公眾健康的嚴(yán)重危害已引起臺(tái)灣及大陸地區(qū)的廣泛關(guān)注。因此,目前國(guó)內(nèi)外許多國(guó)家已經(jīng)開始重視對(duì)DEHP的毒性研究、危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)及安全性監(jiān)督。近年來(lái)DEHP被認(rèn)為是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmentalendocrinedisruptor,EED),已成為全球最普遍的污染物之一,并被美國(guó)國(guó)家環(huán)保局和中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站列為優(yōu)先控制污染物,表現(xiàn)為生殖生長(zhǎng)、肝、腎及血液等方面的毒性。DEHP的急性毒性較低,有研究報(bào)道經(jīng)口給藥后,小鼠的LD50為30g/kg,大鼠為30.6g/kg。對(duì)于DEHP神經(jīng)發(fā)育毒性問(wèn)題,國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少,Andrade等研究認(rèn)為DEHP孕期染毒使新生幼鼠下丘腦視前交叉芳香化酶(Acromatase)表達(dá)減低,并其對(duì)活性產(chǎn)生影響。另外,有研究證明DEHP可以干擾神經(jīng)類固醇水平,由于芳香化酶是合成神經(jīng)類固醇的重要酶類,而神經(jīng)類固醇對(duì)于學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能的調(diào)控具有重要意義,故有人推測(cè)DEHP通過(guò)影響神經(jīng)類固醇水平而影響學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能。因此,DEHP導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制可能是通過(guò)影響芳香化酶開始的。人類可廣泛暴露于鄰苯二甲酸酯類物質(zhì),其中女性因使用含鄰苯二甲酸的化妝品和個(gè)人護(hù)理用品成為鄰苯二甲酸酯的高危人群,DEHP可以通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi),在胎兒體內(nèi)聚集,也可直接作用于胎兒。但如果在孕期接觸DEHP,由于胎兒的血腦屏障尚未發(fā)育完成,DEHP可能通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而影響到子代的腦發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)孕期大鼠暴露DEHP建立子代大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷的動(dòng)物模型,通過(guò)觀察DEHP所致子鼠神經(jīng)行為學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化,探討DEHP對(duì)發(fā)育中子鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響,為其神經(jīng)發(fā)育毒性機(jī)制深入研究提供相關(guān)理論依據(jù)。1材料和方法1.1儀器和試劑DEHP(分析純,美國(guó)Sigma公司);Trizol(美國(guó)Sigma公司);三氯甲烷(分析純,北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司);異丙醇(分析純,山東蜀王實(shí)業(yè)公司);RT-PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司);引物合成(金思特科技南京有限公司)。紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);EPS300電泳儀(上海天能科技有限公司);PCR擴(kuò)增儀(日本株式會(huì)社);恒溫水浴箱(HH-42型,常州國(guó)華電器有限公司);低溫高速離心機(jī)(CF15D,上海日立工機(jī)株式會(huì)社)。1.2大鼠陰栓治療動(dòng)物染毒:清潔級(jí)Wistar大鼠雌性28只,雄性大鼠10只,體重220~250g,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SYXK(遼)2011-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為4組,每組7只。動(dòng)物交配:雌雄大鼠以1∶1同籠,次日晨于盤底及陰道檢查陰栓,查出陰栓者,記為妊娠0d,母鼠編號(hào)稱重,另籠飼養(yǎng),同時(shí)進(jìn)行如下處理。對(duì)照組(給與玉米油);低劑量組:10mg/(kg·d)DEHP;中劑量組:100mg/(kg·d)DEHP;高劑量組:500mg/(kg·d)DEHP。實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物自由飲水,連續(xù)染毒19d至子鼠出生。每7d稱重1次。動(dòng)物室溫度18℃~23℃,相對(duì)濕度45%~55%,于出生后6周進(jìn)行水迷宮和電穿梭試驗(yàn)。試驗(yàn)完成后,子鼠經(jīng)乙醚麻醉后斷頭處死,取海馬組織,保存于-70℃深凍冰箱,用于RT-PCR分析。1.3觀察指標(biāo)和測(cè)試方法1.3.1子鼠的素質(zhì)訓(xùn)練對(duì)出生后6周子鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練,水迷宮由一黑色有機(jī)玻璃長(zhǎng)方體水槽(73×42×20cm)組成,其中有若干隔板組成迷宮,其中有4個(gè)盲端,迷宮的一角有一組臺(tái)階為終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)前,迷宮中灌水,水深10cm,水溫(24±1)℃。訓(xùn)練第1天用隔板將兩個(gè)最近距離的通道阻斷,子鼠被置于臺(tái)階上10s,使其了解此安全區(qū)域的存在,然后將子鼠放于起點(diǎn),讓其自由游泳,記錄其進(jìn)入盲端1的次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))以及爬上安全臺(tái)階的時(shí)間(即潛伏期),如果在訓(xùn)練時(shí)間2min內(nèi)尚未找到臺(tái)階者,將會(huì)被引導(dǎo)到安全臺(tái)階處,其潛伏期被記為2min。第1次訓(xùn)練后休息片刻按同樣方法訓(xùn)練第2次,依次訓(xùn)練其他子鼠。在訓(xùn)練的第2天,將隔板置于另一起點(diǎn),分別記錄2min內(nèi)子鼠進(jìn)入盲端1、2、3的錯(cuò)誤次數(shù)以及爬上安全臺(tái)階的潛伏期,每只子鼠連續(xù)訓(xùn)練2次。如果在2min內(nèi)找不到臺(tái)階者,將被引導(dǎo)到終點(diǎn),其潛伏期被記為2min。訓(xùn)練第3~5天另選子鼠的游泳起點(diǎn),記錄2min內(nèi)子鼠進(jìn)入盲端1、2、3和4的錯(cuò)誤次數(shù)及找到安全臺(tái)階的潛伏期。每只子鼠連續(xù)訓(xùn)練2次后,正式記錄錯(cuò)誤次數(shù)及潛伏期。1.3.2保護(hù)作用下的子鼠將出生后6周的子鼠放置穿梭箱箱體中,蓋好蓋,點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)開始,此時(shí)子鼠在箱體中有3種狀態(tài),其一是擋住左邊紅外光線;其二是擋住右邊紅外光線;其三是中間狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)開始后,無(wú)論是峰鳴階段,還是電刺階段,子鼠若是在中間狀態(tài),擋住左邊或是右邊任一光線,則該次循環(huán)(穿梭)結(jié)束,若是起始狀態(tài)是左邊,則必須擋住右邊的光線才叫完成一次穿梭(循環(huán)),反之亦然。在峰鳴階段完成穿梭叫主動(dòng)逃避,在電刺階段完成穿梭叫被動(dòng)逃避,主動(dòng)逃避后,相應(yīng)的鈴聲結(jié)束,被動(dòng)逃避時(shí)相應(yīng)的電刺結(jié)束,反復(fù)循環(huán)直到設(shè)定的次數(shù)。1.3.3rt-pcr分析Trizol法抽提總RNA溶于DEPC水中。紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為260和280nm的吸光度(A)值,根據(jù)A260/A280比值在1.8~2.0范圍內(nèi)判定RNA污染情況,留取RNA質(zhì)量較好樣品,進(jìn)行RT-PCR分析。1.3.4ssr擴(kuò)增條件及條件優(yōu)化(1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按RT-PCR試劑盒操作指南配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,設(shè)定反應(yīng)條件為30℃10min,45℃25min,99℃5min和5℃5min。(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物設(shè)計(jì)及合成。在GenBank中查找大鼠StAR、CYP19A1及β-actin基因mRNA序列,用PrimePrimer5.0設(shè)計(jì)引物(見表1),BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)特異性分析。PCR反應(yīng)條件為92℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃4min和72℃5min。35次循環(huán)。(3)瓊脂糖凝膠電泳將5μl左右PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,與1μl溴酸蘭混合,混勻后上樣,電泳,設(shè)電流為10mA,電源電壓100V,電泳40min,紫外燈下觀察、拍照。1.4數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析采用EXCEL數(shù)據(jù)庫(kù)錄用數(shù)據(jù),SPSS13.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)描述主要以形式表示。根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性,采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn),LSD進(jìn)行多重比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1不同劑量的有毒大鼠的神經(jīng)行為影響2.1.1dehp組與對(duì)照組試驗(yàn)結(jié)果及錯(cuò)誤次數(shù)情況于子鼠出生6周后,進(jìn)行水迷宮測(cè)試,由表2所示,DEHP各劑量組與對(duì)照組相比,無(wú)論錯(cuò)誤次數(shù)還是潛伏期差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,10、100和500mg/(kg·d)DEHP組與對(duì)照組相比,潛伏期延長(zhǎng)(F=11.221;P=0.000);100和500mg/(kg·d)DEHP組與對(duì)照組相比,錯(cuò)誤次數(shù)增加(F=8.058;P=0.000)。2.1.2電弧次數(shù)和主動(dòng)逃避時(shí)間由表3所示,電穿梭測(cè)試時(shí),DEHP各劑量組與對(duì)照組相比,電擊次數(shù)、主動(dòng)逃避時(shí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,100和500mg/(kg·d)DEHP組與對(duì)照組相比,電擊次數(shù)增加(F=6.984;P=0.000);10、100和500mg/(kg·d)DEHP組與對(duì)照組相比,主動(dòng)逃避時(shí)間延長(zhǎng)(F=9.841;P=0.000)。2.2dehp染毒對(duì)海馬cyp19a1基因表達(dá)的影響由圖1所示,不同劑量的DEHP染毒對(duì)海馬組織類StAR基因轉(zhuǎn)錄的影響并不明顯。由表4所示,經(jīng)方差分析,差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.039;P=0.290),對(duì)照組與低、中、高3個(gè)劑量組的灰度比值之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),尚未發(fā)現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系存在。由圖2所示,不同劑量的DEHP染毒對(duì)海馬組織CYP19A1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。隨著DEHP染毒劑量由低到高,CYP19A1基因擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中顯示的條帶由亮到暗,出現(xiàn)一定的劑量關(guān)系,尤其是對(duì)照組與500mg/kg劑量組條帶的明暗對(duì)比更為顯著。由表4所示,對(duì)CYP19A1基因凝膠電泳圖像灰度進(jìn)行分析,對(duì)照組目的基因CYP19A1與β-actin灰度比值明顯大于DEHP染毒組,隨著DEHP染毒劑量由低到高灰度比值呈減小趨勢(shì)。對(duì)其灰度值比值進(jìn)行方差分析,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.083;P=0.049)。3dehp對(duì)妊娠大鼠海馬中ndv的影響DEHP可能會(huì)引起神經(jīng)毒性,但國(guó)內(nèi)外相關(guān)系統(tǒng)報(bào)道較少。文獻(xiàn)記載利用質(zhì)譜分析儀檢測(cè)到小鼠腦組織中的痕量DEHP;在大鼠的腦組織中有人也曾檢測(cè)到DEHP的代謝產(chǎn)物MEHP,但也有研究認(rèn)為DEHP或其代謝產(chǎn)物是否通過(guò)成熟血腦屏障值得懷疑。胚胎的血腦屏障尚未發(fā)育完成,如果母體孕期接觸DEHP,則其可能通過(guò)胎盤進(jìn)入并蓄積于胎兒體內(nèi),通過(guò)發(fā)育尚未完全的血腦屏障而進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而影響到子代的腦發(fā)育。目前對(duì)DEHP的發(fā)育神經(jīng)毒性機(jī)制尚無(wú)明確的結(jié)論,很可能是多種途徑和多種因素相互作用的結(jié)果。通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨著DEHP的染毒劑量增加,子鼠在水迷宮測(cè)試時(shí),DEHP各劑量組與對(duì)照組相比,無(wú)論錯(cuò)誤次數(shù)還是潛伏期差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;電穿梭測(cè)試時(shí),DEHP各劑量組與對(duì)照組相比,電擊次數(shù)、主動(dòng)逃避時(shí)間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?DEHP中高劑量染毒可以使子鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降,提示在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵期如暴露DEHP會(huì)影響神經(jīng)行為的發(fā)育。芳香化酶是屬于細(xì)胞色素P450的一種復(fù)合酶,通常說(shuō)的芳香化酶特指P450arom,其含有亞鐵血紅素以及類固醇結(jié)合域。Andrade和Liu等研究認(rèn)為DEHP孕期染毒使新生幼鼠下丘腦視前交叉芳香化酶表達(dá)減低,并對(duì)其活性產(chǎn)生影響,而芳香化酶是神經(jīng)類固醇脫氫表雄酮(DEHA)及硫酸酯(DEHAS)合成代謝的重要輔酶,而神經(jīng)類固醇對(duì)于學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能的調(diào)控具有重要意義。有文獻(xiàn)指出,幾乎所有動(dòng)物的芳香化酶都是由單一CYP19A1基因編碼,而研究子鼠海馬神經(jīng)元CYP19A1基因轉(zhuǎn)錄情況對(duì)于解釋DEHP是否干擾神經(jīng)類固醇的合成代謝具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的DEHP染毒對(duì)海馬組織CYP19A1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。隨著DEHP染毒劑量由低到高,CYP19A1基因轉(zhuǎn)錄降低,尤其是對(duì)照組與500mg/kg劑量組條帶的明暗對(duì)比更為顯著。對(duì)CYP19A1基因凝膠電泳圖像灰度進(jìn)行分析,對(duì)照組目的基因CYP19A1與β-actin灰度比值明顯大于DEHP染毒組,隨著DEHP染毒劑量由低到高灰度比值呈減小趨勢(shì)。對(duì)其灰度值比值進(jìn)行方差分析,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.083,P=0.049)。CYP19A1基因轉(zhuǎn)錄的減低說(shuō)明DEHP影響芳香化酶的合成,可以導(dǎo)致神經(jīng)類固醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的減低。大量事實(shí)已經(jīng)證明,類固醇激素合成的信號(hào)使類固醇急性調(diào)控蛋白(StAR)在其合成通路中,參與膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的作用,故對(duì)神經(jīng)類固醇的表達(dá)有一定