s萘普生分子印跡聚合物的合成與結(jié)構(gòu)表征

s萘普生分子印跡聚合物的合成與結(jié)構(gòu)表征

分子印花技術(shù)是一種新型有效的分離技術(shù)，旨在模擬生物內(nèi)的抗體、酶或酶與底物之間的專一性相互作用而發(fā)展的。分子印花聚合物是由該技術(shù)制備的具有特定識(shí)別功能的高聚物。通過(guò)將高聚物分子整合到聚合物分子（測(cè)量或分離的分子）、功能單體、交聯(lián)劑和可能的固狀材料后，對(duì)模型分子進(jìn)行清洗、去除，然后獲得模型分子。聚合物中模型分子留下的空孔和空孔中的活性基團(tuán)與模型分子的形狀和官能團(tuán)是互補(bǔ)的。即使是難以分離的異構(gòu)體，也可以進(jìn)行分析和分離。作為一種高選擇性分子分子，該算法在分子識(shí)別和生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的免疫分析中具有良好的應(yīng)用前景，引起了人們的關(guān)注。萘普生(2-(6-甲氧基-2-萘基)-丙酸),為2-芳基丙酸類藥物,是解熱、鎮(zhèn)痛、消炎抗風(fēng)濕的基本藥物,其中α位為手性碳原子,因此存在一對(duì)光學(xué)活性對(duì)映體.臨床研究表明,萘普生S-(+)-構(gòu)型的藥效為R-(-)-構(gòu)型的28倍.為了減少用藥量及避免對(duì)人體的毒副作用,萘普生將被要求逐漸以純對(duì)映異構(gòu)體形式上市,這對(duì)萘普生的拆分及檢測(cè)提出了較高要求.本文以丙烯酰胺為功能單體合成了(S)-萘普生分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymer,MIP),研究其對(duì)(S)-萘普生的識(shí)別特性.分析了不同濃度的功能單體丙烯酰胺對(duì)(S)-萘普生的紫外吸收光譜的影響,為MIP的制備提供依據(jù).模板分子與功能單體的復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)用Hyperchem軟件進(jìn)行模擬,并計(jì)算其結(jié)合能.檢測(cè)了分子印跡聚合物對(duì)模板分子(S)-萘普生及其對(duì)映異構(gòu)體(R)-萘普生的選擇性結(jié)合能力,并計(jì)算了分離因子α.用Scatchard分析法評(píng)價(jià)了MIP的結(jié)合等溫線,并得到高親和力和低親和力的結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)Kd和最大表觀結(jié)合常數(shù)Qmax.1實(shí)驗(yàn)部分1.1-三甲基苯甲酰苯基磷酸乙酯(S)-萘普生和(R)-萘普生(浙江省天新藥物化工有限公司);交聯(lián)劑二丙烯酸丁二酯(BDDA)及光引發(fā)劑2,4,6-三甲基苯甲酰苯基磷酸乙酯(LR8893X)(德國(guó)BASF公司);丙烯酰胺、氯仿、甲醇及乙酸等試劑(上?；S).2201型紫外可見(jiàn)分光光度儀(日本Shimadzu公司);THZ-82型恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);100CX液氮N2吸附儀(美國(guó)OMNISORP公司);Hyperchem7.0軟件(Hypercube,Inc).1.2功能單體丙烯酰胺的檢測(cè)模板分子(S)-萘普生的濃度固定為C0=0.5mmol/L,加入不同量的功能單體丙烯酰胺(濃度C1分別為0,0.5,1.0,2.0,4.0mmol/L),在恒溫器中振蕩12h后,用相應(yīng)濃度的丙烯酰胺溶液作為參比液,檢測(cè)紫外吸收光譜的變化.1.3結(jié)構(gòu)模擬和分析方法因?yàn)楝F(xiàn)代計(jì)算方法還難以模擬高度交聯(lián)的MIP結(jié)構(gòu),目前主要著重于MIP制備的第1步,即模擬模板分子和功能單體分子形成的復(fù)合物.用Hyperchem7.0模擬此復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu).首先分別模擬(S)-萘普生及丙烯酰胺的最低能量構(gòu)象的分子結(jié)構(gòu),然后經(jīng)過(guò)系統(tǒng)能量?jī)?yōu)化得到兩者形成復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu).1.4空白聚合物的制備取模板分子(S)-萘普生(4mmol)和功能單體丙烯酰胺(16mmol)充分溶解于氯仿中,再加入交聯(lián)劑BDDA(80mmol)和引發(fā)劑LR8893X(50mg),通N2,10min后,于4℃,紫外燈光照下聚合48h,得到白色固狀聚合物.用甲醇-乙酸(體積比為8∶2)洗脫聚合物至洗脫液中檢測(cè)不出模板分子,最后用甲醇洗去殘留乙酸,真空干燥至恒重.空白聚合物如上法所制備,只是不加入模板分子.1.5復(fù)配體分離性測(cè)定取聚合物20.0mg放入10mL錐形瓶中,加入2.0mL已知濃度的(S)-萘普生或其對(duì)映異構(gòu)體(R)-萘普生的氯仿溶液,于室溫下在恒溫振蕩器中振蕩24h.然后將此混合物轉(zhuǎn)入離心機(jī)中以10000r/min轉(zhuǎn)速離心10min.用紫外分光光度儀測(cè)定(S)-萘普生或其對(duì)映異構(gòu)體的平衡濃度.根據(jù)結(jié)合前后溶液中濃度的變化計(jì)算聚合物對(duì)底物的結(jié)合量.平行測(cè)定3次取平均值.結(jié)合分配系數(shù)KD=CpCsΚD=CpCs式中,Cp為聚合物結(jié)合底物的濃度;Cs為溶液中底物的平衡濃度.分離因子α可定義為2種不同底物的結(jié)合分配系數(shù)之比.為研究聚合物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)性質(zhì),取50.0mg聚合物與5.0mL的濃度為2.0mmol/L的(S)-萘普生氯仿溶液混合,在不同的時(shí)間分別測(cè)定(S)-萘普生在聚合物上的結(jié)合量.2結(jié)果和討論2.1克氏原螯蝦c-普生-四氫化反應(yīng)中金屬酶表型的變化在濃度C0=0.5mmol/L的(S)-萘普生氯仿溶液中分別加入濃度不同的丙烯酰胺,觀察(S)-萘普生的紫外光譜的變化,研究模板分子與單體之間的作用力.如圖1所示,隨著丙烯酰胺濃度C1的增加,(S)-萘普生的最大紫外吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移,而且波峰強(qiáng)度在不斷降低.這說(shuō)明在模板分子和功能單體之間確實(shí)已產(chǎn)生了作用力并形成復(fù)合物.根據(jù)模板分子和功能單體的結(jié)構(gòu),兩者之間的作用力應(yīng)該是氫鍵.2.2分子丙烯酰胺與一分子s-普生-分子s-分子s-分子s-分子s-分子s-分子s-分子s-分子(S)-萘普生與丙烯酰胺形成的復(fù)合物的可能結(jié)構(gòu)用Hypechem軟件模擬,如圖2所示.其中較大的分子為(S)-萘普生,旁邊的小分子為丙烯酰胺.(S)-萘普生與丙烯酰胺組裝的可能模型有2類,模型1為一分子丙烯酰胺與一分子(S)-萘普生的羧基形成2個(gè)氫鍵;模型2為兩分子丙烯酰胺與一分子(S)-萘普生結(jié)合,除了前面提到的氫鍵,丙烯酰胺與(S)-萘普生的甲氧基之間也形成氫鍵.這2種復(fù)合物都有可能出現(xiàn)在高分子母體材料中,經(jīng)過(guò)模板洗脫后,就能形成2種識(shí)別(S)-萘普生的印跡空穴.一分子丙烯酰胺與一分子(S)-萘普生的結(jié)合能計(jì)算得到-355.68kJ/mol,而兩分子丙烯酰胺與一分子(S)-萘普生的結(jié)合能計(jì)算得到-616.42kJ/mol.前者形成低親和力的結(jié)合位點(diǎn),而后者形成高親和力的結(jié)合位點(diǎn).圖2(S)-萘普生和丙烯酰胺形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型2.3mip對(duì)模板分子的作用測(cè)定了(S)-萘普生MIP對(duì)不同濃度的模板分子(S)-萘普生的結(jié)合量Q,繪制成結(jié)合等溫線,其中(S)-萘普生的濃度C0從0變化到5.0mmol/L,如圖3中曲線a.MIP對(duì)(R)-萘普生及空白聚合物對(duì)(S)-萘普生的結(jié)合等溫線分別見(jiàn)圖3中曲線b和c.比較曲線a與c可知,MIP對(duì)模板分子的結(jié)合量要明顯高于空白聚合物.這說(shuō)明印跡過(guò)程中,模板分子在MIP中留下的印跡空穴及空穴上的活性結(jié)合位點(diǎn)決定了MIP對(duì)模板分子的高度親合力和特異識(shí)別性.曲線a和b表明(R)-萘普生在MIP上的結(jié)合量要比(S)-萘普生低,這是因?yàn)?R)-萘普生的分子結(jié)構(gòu)不能與MIP中的印跡空穴的形狀吻合,并不能同(S)-萘普生一樣和空穴上的結(jié)合位點(diǎn)形成較強(qiáng)的作用力而造成在MIP上的結(jié)合性不強(qiáng).在底物濃度為2.0mmol/L時(shí),測(cè)定了MIP對(duì)(S)-萘普生的結(jié)合分配系數(shù)KD=76.6mL/g,明顯高于空白聚合物對(duì)(S)-萘普生的KD=14.1mL/g.MIP對(duì)(R)-萘普生的KD值為40.97mL/g,則手性分離因子α=1.87,表明MIP對(duì)模板分子及其對(duì)映異構(gòu)體有較好的選擇性.2.4mip中的結(jié)合位點(diǎn)MIP對(duì)(S)-萘普生的結(jié)合等溫線可用Scatchard法分析,其等式為QC0=Qmax?QKdQC0=Qmax-QΚd式中,Q為MIP對(duì)(S)-萘普生的結(jié)合量;Qmax為表觀最大結(jié)合常數(shù);Kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù).以Q/C0對(duì)Q作圖得到圖4.當(dāng)Scatchard曲線是非線性的,表明MIP對(duì)(S)-萘普生的結(jié)合位點(diǎn)是各向異性的.圖4中的點(diǎn)分布在2個(gè)部分,并分別具有明顯的線性關(guān)系,這表明MIP中可能存在2種結(jié)合位點(diǎn).圖4中左邊實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(▲)的回歸直線方程是y=-35.6818x+94.4559,其回歸常數(shù)r=0.9987.由回歸模型的斜率和截距,計(jì)算得高親和力的結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)Kd,1和最大表觀結(jié)合常數(shù)Qmax,1分別為28.0μmol/L和52.94μmol/g.右邊實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(■)的回歸直線方程是y=-2.0458x+12.5021,其回歸常數(shù)r=0.9858,計(jì)算得低親和力的結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)Kd,2和最大表觀結(jié)合常數(shù)Qmax,2分別為0.489mmol/L和0.122mmol/g.MIP中存在2種結(jié)合位點(diǎn)主要是由于模板分子和功能單體在聚合過(guò)程之前可形成2種復(fù)合物(如2.2中模擬所示),在聚合過(guò)程中被固定下來(lái),并隨后因洗脫而在MIP中形成2種結(jié)合位點(diǎn).2.5結(jié)合速率的確定為測(cè)量(S)-萘普生在MIP上的結(jié)合速率,通過(guò)紫外檢測(cè)了濃度為2.0mmol/L的(S)-萘普生在50.0mgMIP上不同時(shí)間的結(jié)合量,如圖5所示.在前40min,結(jié)合速率非常快,幾乎呈線性關(guān)系,然后結(jié)合速率有所降低.2h后,結(jié)合量基本達(dá)到飽和.這是因?yàn)槲介_(kāi)始階段,模板分子被聚合物表面的印跡孔穴捕獲,結(jié)合速率較快.在表面空穴被飽和后,模板分子要傳送到聚合物內(nèi)部的空穴需花更長(zhǎng)的時(shí)間,結(jié)合速率變慢.2.6聚合物洗脫前后孔結(jié)構(gòu)比較用液氮吸附儀多點(diǎn)BET法測(cè)得MIP洗脫后的總孔體積為0.1759cm3/g,比表面積為137.96m2/g,均高于聚合物洗脫前的總孔體積0.1032cm3/g及比表面積105.86m2/g.可以看出MIP為多孔材料,而洗脫后聚合物中孔結(jié)構(gòu)與洗脫前相比要多得多.正是這種孔結(jié)構(gòu)上的差異,造成MIP對(duì)模板分子的良好選擇性,而這孔結(jié)