中國南部6個紅樹群落木欖葉片的總黃酮含量

中國南部6個紅樹群落木欖葉片的總黃酮含量

木橄欖是紅木科的一種鹽生植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶沿海地區(qū)的沖積帶。早期有關(guān)木欖的研究主要集中在對該植物的分類、分布、生理、生態(tài)以及對鹽生環(huán)境的適應(yīng)性研究方面,有關(guān)其藥效活性成分的研究報道相對較少。長期以來的民間應(yīng)用實踐證明:木欖具有潛在的藥用價值,主要表現(xiàn)在清熱解毒、止瀉、收斂、止血及截瘧等方面,被廣泛應(yīng)用于治療發(fā)燒、腹瀉、止血、眼疾、咽喉腫痛以及對抗瘧原蟲等,但迄今很少見有關(guān)其藥效活性成份的報道。黃酮類化合物是植物中廣泛分布的一類次生代謝產(chǎn)物,在植物的生長發(fā)育和抗逆等過程中發(fā)揮著重要的作用;此外,來自植物的黃酮類化合物往往還具有抗氧化、抗菌、消炎、抗腫瘤以及抗病毒等藥理活性,已經(jīng)成為新藥研究中重要的先導(dǎo)化合物來源。近年來,有關(guān)植物體內(nèi)黃酮類化合物的研究報道呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢。大量研究顯示,在高鹽、強紫外輻射、水淹、低溫、高溫以及干旱等條件下,植物體內(nèi)的黃酮類化合物有蓄積的趨勢,這種蓄積與其抗逆過程相關(guān)。鑒于木欖主要分布在高鹽和強紫外輻射的赤道附近潮間帶,我們推測木欖體內(nèi)的黃酮類化合物含量較高,并具有多樣性的特點。但迄今為止,僅從木欖中分離到一種黃酮類化合物。在前期研究過程中,本課題組從木欖葉片中分離到4種黃酮類化合物,其中一種為新化合物(已申請專利),另外三種為木欖屬植物中首次報道。初步的研究顯示:這些黃酮類化合物的含量在不同木欖群落中具有較為明顯的差異,揭示這些差異與環(huán)境因子(如:溫度、鹽度、pH以及降雨量等)的相關(guān)性將有助于為對木欖這種具有潛在藥用價值的鹽生植物的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。本研究對不同紅樹群落來源以及同一紅樹群落中處于不同生長季節(jié)的木欖葉片中總黃酮含量的變化進行了分析,結(jié)合多因素統(tǒng)計分析方法比較了這些化合物含量與環(huán)境因子的相關(guān)性。結(jié)果證明木欖葉片中黃酮類化合物的產(chǎn)生和蓄積主要受到環(huán)境中年均氣溫的影響,其在一年中的動態(tài)變化與溫度呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)性。1材料和方法1.1樣品的采集和處理木欖[B.gymnorhiza]樣品采集于廣東省湛江市特呈島(Techeng,N21o17′,E110o22′)和高橋(Gaoqiao,N21o55′,E109o74′)、廣西省山口紅樹林保護區(qū)(Shankou,N21o51′,E109o66′)以及海南省的東寨港紅樹林保護區(qū)(Dongzhai,N19o98′,E110o52′)、文昌頭苑(Wenchang,N19o62′,E110o74′)和三亞(Sanya,N18o14′,E109o51′)等地的紅樹群落。在每個紅樹群落中選擇一塊100×100m2樣方,在樣方內(nèi)隨機挑選20~30株木欖,并從每株木欖上取下成熟葉片,按不同地區(qū)分類保存?zhèn)溆?。樣品采集時間為2005年3月~2006年12月,于每月25~30日間采樣。采樣時,采樣地區(qū)要求連續(xù)1周未降雨。木欖材料由海南東寨港紅樹林保護區(qū)的鐘才榮鑒定,植物憑證標(biāo)本保存于中國藥科大學(xué)海洋藥用生物資源學(xué)教研室。1.2采樣點的經(jīng)度和自由度年平均氣溫、年降雨量、年日照時間和月平均氣溫收集于采樣地區(qū)的林業(yè)和農(nóng)業(yè)部門。采樣點的經(jīng)度和緯度用美國Garmin美洲豹GPS12測定,采樣時的溫度、濕度和土壤鹽度等分別于2005年3月28~4月2日和2006年3月25~3月31日間測定,兩次測定數(shù)據(jù)基本穩(wěn)定(表1和表2)。1.3丁標(biāo)準(zhǔn)液的配制標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁(Rutin)由本實驗室制備,純度為99.2%,經(jīng)105℃下干燥至恒重后,準(zhǔn)確稱取3.5mg,于適量蒸餾水中加熱溶解,定容至25mL,制成濃度為0.14mg?mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL,分別加到10mL容量瓶中,再加入5%的NaNO2溶液0.3mL,放置5min后,加入10%的Al(NO3)3溶液0.3mL,搖勻后放置6min,繼續(xù)加入1mol?L-1的NaOH溶液2mL,加水定溶至10mL,于510nm處分別測定吸光度A510值,得蘆丁質(zhì)量(Y,mg)與吸光度A510間的回歸方程:Y=0.027+0.9916A510(r2=0.9939),根據(jù)此方程,總黃酮含量在0~0.84mg范圍內(nèi)與吸光度A510呈良好線性關(guān)系。1.4總黃酮提取液的制備從每個紅樹群落樣品中隨機取20株木欖植株的新鮮葉片,用蒸餾水沖洗干凈后混合,50℃烘72h,將葉片粉碎并過100目篩。精密稱取0.5g粉末若干份,按不同提取溶劑、提取方式進行考察。將樣品放入圓底燒瓶中,加入50mL溶劑進行提取,過濾得濾液,再將濾渣用甲醇洗3遍,合并濾液并蒸干,加入100mL水制成總黃酮提取液。取2mL樣品,按以上測標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測黃酮總含量,以總黃酮量(mg)占每克干重(g)的比值表示。1.4.1總黃酮含量的優(yōu)化80℃加熱回流2h,對甲醇、乙醇和80%甲醇3種溶劑進行了優(yōu)化,總黃酮含量分別為(82.5±0.2)、(76.8±0.2)和(55.6±0.2)mg?g-1,可見甲醇提取最完全,故用甲醇作提取液進行后續(xù)進一步考察。1.4.2總黃酮含量的測定對甲醇索氏提取、80℃加熱回流、超聲提取2h進行了考察?？傸S酮含量分別為(72.3±0.3)、(82.5±0.2)和(82.2±0.2)mg?g-1,加熱回流和超聲提取效果接近,但加熱回流提取更完全。1.4.3總黃酮含量的測定采用甲醇80℃加熱回流,對提取時間為1、2、3h分別進行了考察,總黃酮含量分別為(82.6±0.3)、(82.5±0.3)和(81.7±0.2)mg?g-1,因此,1h的提取已經(jīng)完全。綜上研究結(jié)果,確定木欖葉片中總黃酮的最佳提取條件為甲醇80℃加熱回流提取1h。1.5總黃酮含量測定精密稱取木欖葉片粉末500mg左右,平行6份,按最佳條件制備供試品溶液,以外標(biāo)法計算總黃酮含量(mg?g-1),分析測定結(jié)果的RSD值。重復(fù)性結(jié)果表明木欖葉片中總黃酮平均含量為82.4mg?g-1,RSD為0.2%。1.6精密度測試精密稱取木欖葉片粉末500mg左右,平行6份,按最佳條件進行檢測,RSD為1.5%,表明本法精密度良好。1.7返回率測試精密稱取木欖葉片粉末500mg左右,平行6份,按最佳條件進行檢測,總黃酮平均加樣回收率為102.1%,RSD為1.8%。1.8環(huán)境因子對紅樹群落聚類分析和經(jīng)濟效益的影響數(shù)據(jù)以2005年度和2006年度測定數(shù)據(jù)的平均值±SD表示。以總黃酮含量為變量,用SPSS11.5軟件對不同紅樹群落中的木欖樣品作聚類分析。將鹽度、年均氣溫、采樣溫度、相對濕度、年降雨量和年日照時間與總黃酮含量作相關(guān)分析,分別求出其相關(guān)系數(shù)r,對于顯著相關(guān)的環(huán)境因子,以其為變量X,總黃酮含量為Y,進行一元回歸分析,求出在環(huán)境因子變化的情況下,總黃酮含量在正態(tài)回歸情況下的期望值為Y=a+bX。對數(shù)據(jù)進行F檢驗,以P<0.05為顯著性差異。2結(jié)果2.1不同紅樹群落木欖聚類分析不同紅樹群落來源的木欖葉片總黃酮含量呈現(xiàn)出顯著的差異(圖1A)。海南3個紅樹群落,即:東寨港、文昌和三亞群落中木欖的總黃酮含量較低,明顯低于廣東高橋、特呈島及廣西山口紅樹群落的木欖。在所有6個紅樹群落中,以山口群落中的木欖總黃酮含量最高,達(dá)到55.4mg?g-1,而海南三亞群落中木欖的總黃酮含量最低,只有15.9mg?g-1(圖1A),兩者間相差約3.5倍。根據(jù)總黃酮含量的變化情況,對6個紅樹群落中的木欖進行了聚類分析,結(jié)果6個紅樹群落中的木欖可聚為2組,其中海南東寨港、文昌和三亞群落為Ⅰ組,廣東的高橋、特呈島及廣西的山口群落為Ⅱ組(圖1B)。Ⅰ組和Ⅱ組間的總黃酮含量差異平均約為2.7倍。上述聚類結(jié)果體現(xiàn)了木欖葉片中總黃酮含量的地域分布特點,即:隨著緯度的降低,總黃酮的含量總體上呈現(xiàn)出下降的趨勢(表1)。2.2響應(yīng)面回歸分析表1,表4根據(jù)6個紅樹群落中的各個環(huán)境因子數(shù)據(jù)(表1)和木欖葉片中總黃酮含量(圖1A)分析結(jié)果,利用SPSS11.5軟件對環(huán)境中影響總黃酮含量變化的主因子進行了分析(表3)。經(jīng)顯著性檢驗,6個紅樹群落中木欖葉片總黃酮含量與年均氣溫呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.903,P=0.014),木欖葉片總黃酮含量(Y)和年均氣溫(X)之間的回歸方程為:Y=350.191-13.435X,r=-0.903。統(tǒng)計分析結(jié)果同時顯示:木欖葉片中總黃酮含量的變化與環(huán)境中的鹽度、采樣溫度、相對濕度、年降雨量、年日照時間和土壤pH之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)。2.3不同季節(jié)動態(tài)紅樹群落木欖葉片總黃酮含量的變化對2005年3月至2006年12月間采自海南文昌和東寨港紅樹群落中木欖葉片總黃酮含量的變化進行了分析,結(jié)果顯示:文昌和東寨港紅樹群落中木欖葉片總黃酮含量分別在12月份和11~12月份(未采集到文昌紅樹群落1、2、11月份及東寨港紅樹群落1、2、7、10月份的木欖樣品)達(dá)到最高,兩個紅樹群落中木欖葉片總黃酮含量在3~9月份明顯偏低(圖2)。上述變化與產(chǎn)地氣溫的變化之間可能有一定的聯(lián)系,資料顯示:這兩個產(chǎn)地以12月和1月氣溫最低,而在2月份后氣溫逐漸回升,至7-9月份達(dá)到最高(表2)。3溫度和溫度對木欖葉片總黃酮含量的影響黃酮作為植物次生代謝產(chǎn)物,其在植物體內(nèi)的含量受到多種環(huán)境因子(如:溫度、鹽度、光照以及水分等)的影響。本文的研究結(jié)果證明木欖葉片中總黃酮含量與年均氣溫呈負(fù)相關(guān)性,這可能與較低的溫度有利于黃酮類物質(zhì)的積累有關(guān)。盡管有大量的研究顯示:黃酮類化合物的生物合成途徑在鹽脅迫條件下有明顯加強的趨勢,但本研究中并未檢測到木欖葉片中總黃酮含量的變化與環(huán)境中鹽度的變化呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性(r=0.237,P=0.652)。同時,木欖葉片中總黃酮含量的變化與其環(huán)境中的其它環(huán)境因子(如:采樣溫度、相對濕度、年降雨量、年日照時間以及土壤pH等)也沒有顯著的相關(guān)性,這與其它一些報道不一致,其原因有待進一步分析。對海南兩個紅樹群落(文昌和東寨港)中木欖葉片總黃酮含量季節(jié)變化規(guī)律的分析結(jié)果顯示:較低的氣溫可能有利于木欖葉片中黃酮類化合物的合成和蓄積。大量的研究顯示:黃酮類化合物的合成受到其生物合成途徑中多種轉(zhuǎn)錄激活因子(如:C1-Myb等)