靶向igf1r基因mirp0-shrna慢病毒對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

靶向igf1r基因mirp0-shrna慢病毒對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

大多數(shù)核電站癌患者的igf1r顯示出高發(fā)現(xiàn)，并對(duì)腫瘤產(chǎn)生了重要影響。與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖明顯地依賴于人胰島素樣生長(zhǎng)因子1類受體(IGF1R)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),且有顯著的降調(diào)節(jié)機(jī)制缺陷,腫瘤細(xì)胞的IGF1R表達(dá)水平可比正常細(xì)胞高幾千倍。IGF1R通路信號(hào)的阻斷能顯著地削弱腫瘤在體內(nèi)、外狀態(tài)下的存活能力,并增強(qiáng)其對(duì)輻射、細(xì)胞毒等應(yīng)急因素介導(dǎo)殺傷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建靶向沉默IGF1R的miR30-shRNA慢病毒載體,探討其轉(zhuǎn)染后對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,企為肝癌基因治療拓展新的思路。1材料和方法1.1材料表面1.1.1藥物、試劑與試劑盒兔抗人IGFIR多克隆抗體購(gòu)于SantCruze公司;Lipofectamin2000購(gòu)于Invitrogen公司;限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)于大連寶生物公司;CCK-8試劑盒購(gòu)于DOJINDO公司;質(zhì)粒提取試劑盒、回收試劑盒購(gòu)于上海生物工程有限公司;多聚酶鏈反應(yīng)引物和其他試劑購(gòu)于博亞公司。1.1.2胞33t細(xì)胞系統(tǒng)人肝癌細(xì)胞株HEP3B,SMMC7721和大腸桿菌DH5α細(xì)胞株均由國(guó)家人類基因組南方研究中心提供。慢病毒的包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株來(lái)源于中科院上海細(xì)胞所。重組慢病毒pPRIME(potentRNAiusingmicroRNAexpression)系統(tǒng)由申海蓮博士贈(zèng)。該病毒包裝系統(tǒng)由pPRIME,psPAX2和pMD2G3種質(zhì)粒組成;其中pPRIME含有能持續(xù)表達(dá)miR30-shRNA的元件,PsPAX2和pMD2G含有病毒包裝所必須的元件。1.1.3orna靶序列的設(shè)計(jì)根據(jù)IGF1R基因序列(NM_000875),應(yīng)用RNAi設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)shRNA,用BLAST對(duì)選的靶序列進(jìn)行同源分析,排除非特異性shRNA,選擇IGF1R基因cDNA序列中21nt片段為合成的microRNA靶序列,其序列為ATCAACGGCCTATTGTCAGGT。根據(jù)pPRIME載體的要求,設(shè)計(jì)97nt的長(zhǎng)鏈序列:5′-TGCTGTTGACAGTGAGCGAATCAACGGCCTATTGTCAGGTTAGTGAAGCCACAGATATGGACTGTTATCCGGCAACTACTGCCTACTGCCTCGGA-3′同時(shí)設(shè)計(jì)1對(duì)兩端分別含有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物。其序列分別為:P1,5′-CTGCTCGAGACGACAACTGTCACTCGCTTAGTTG-3′;P2,5′-GAGGAATTCTCCGAGGCAGTAGGCAGTAGTTGCC-3′。序列由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1瓊脂糖凝膠電泳以合成的97nt的長(zhǎng)鏈為模版,加入引物P1,P2和pfu聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,回收PCR產(chǎn)物。與經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切后的pPRIME載體連接,轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌,挑取重組陽(yáng)性克隆行XhoI和EcoRI雙酶切及測(cè)序鑒定,提取質(zhì)粒名為survivin-pPRIME-IGF1R-miR30-shRNA。1.2.2病毒顆粒轉(zhuǎn)染將上述質(zhì)粒pPRIME-IGF1R-miR30-shRNA,pMD2G和psPAX2(3質(zhì)粒系統(tǒng)),通過(guò)lipofectamin2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,經(jīng)過(guò)病毒空斑純化,包裝成完整病毒顆粒。提取重組病毒DNA,PCR分析、測(cè)序鑒定正確者,即為目的病毒PRIME-IGF1R-miR30-shRNA。1.2.3病毒回復(fù)突變?cè)囼?yàn)取96孔板1塊,每孔加293T細(xì)胞1×104個(gè),加液量200μL,孵箱培養(yǎng)24h后更換無(wú)血清培養(yǎng)液;待測(cè)病毒用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6等稀釋度。每一濃度設(shè)3復(fù)孔,每孔每一濃度取病毒溶液200μL,同時(shí)設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照;在37℃,5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)36～48h。鏡檢觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CEP)現(xiàn)象,按公式算出病毒滴度。病毒滴度(pfu/mL)=每孔細(xì)胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)×10/加入的病毒溶液量(mL)。1.2.4逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈ndt將Hep3B和SMMC7721細(xì)胞低密度鋪于6孔板,1d后用MOI=10的pPRIME-IGF1R-miR30-shRNA感染細(xì)胞,未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。48h后trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用隨機(jī)引物OligdTs合成第一鏈(嚴(yán)格按廠家說(shuō)明書進(jìn)行),在20μL反應(yīng)體系中加入2μg總cDNA。引物序列:上游為5′-GGAGGCTGAATACCGCAAAGTC-3′,下游為5′-AAAGACGAAGTTGGAGGCGCT-3′;擴(kuò)增產(chǎn)物為398bp。內(nèi)參照β-actin上游為5′-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′,下游為5′-CAGTGTACAGGTAAGCCCTG-3′。退火溫度均為55℃。在同一條件下,每次PCR以β-actin為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀掃描成像,表達(dá)豐度以特異基因條帶亮度與內(nèi)參照的比值表示。1.2.5sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳IGF1R蛋白將Hep3B和SMMC7721細(xì)胞低密度鋪于6孔板,1d后用MOI(感染復(fù)數(shù))=10.0的PRIME-IGF1R-miR30-shRNA感染細(xì)胞,未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。48h后提取蛋白,取40μg細(xì)胞裂解液與上樣緩沖液混合,煮沸10min后上樣,進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳條件:60V,30min;160V,1.5h。電泳結(jié)束后,電轉(zhuǎn)移法將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上;甲醇固定醋酸纖維膜后,用含5%脫脂奶粉的封閉液40C孵育過(guò)夜。一抗10mL(1∶1000稀釋)室溫孵育2h,二抗10mL(1∶5000稀釋)室溫孵育2h后,醋酸纖維膜用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理并在暗室顯影。1.2.6細(xì)胞增殖檢測(cè)按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,操作如下:分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞,以每孔4×104～5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,每孔體積為200μL;24h后換不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞靜止;將M0I=10的PRIME-IGF1R-miR30-shRNA感染Hep3B細(xì)胞。感染48h后,吸盡待測(cè)孔內(nèi)培養(yǎng)上清液;在酶聯(lián)免疫分析儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD),繪制生長(zhǎng)曲線,觀察各組細(xì)胞連續(xù)7d的細(xì)胞的增殖情況。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。1.2.7細(xì)胞凋亡檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞株,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL接種于6孔板(1.5mL/孔,底部襯附無(wú)菌蓋玻片)培養(yǎng)12h后,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至50%～70%,制備細(xì)胞爬片,各組加入MMC(243μg/mL)誘導(dǎo)凋亡,培養(yǎng)24h后進(jìn)行檢測(cè)。3個(gè)重復(fù)孔。凋亡結(jié)果判定:細(xì)胞核有深棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI)=陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。1.3統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)t標(biāo)準(zhǔn)差表示,經(jīng)SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1pprime酶切鑒定pPRIME-IGF1R-miR30-shRNA轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,挑取重組陽(yáng)性克隆,行XhoI和EcoRI雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆,片段大小約為96bp左右,但因片段太小不易觀察到(圖1)。電泳結(jié)果示:pPRIME-IGF1R-miR30-shRNA與對(duì)照組pPRIME酶切相比,前者未見(jiàn)1100bp左右的帶型,結(jié)果與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果表明,合成的IGF1R-miR30-shRNA寡核苷酸鏈序列插入正確,命名穿梭質(zhì)粒載體為pPRIME-IGF1R-miR30-shRNA。2.2細(xì)胞培養(yǎng)是影響其細(xì)胞基因型的因素表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,293T細(xì)胞部分融合,出現(xiàn)多核復(fù)合體。隨著病毒的增殖,細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)多量病毒顆粒,細(xì)胞逐漸從壁上脫落,出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)。病毒滴度測(cè)定結(jié)果顯示重組慢病毒表達(dá)克隆的滴度為4.58×109pfu/L。2.3igfir的表達(dá)RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,398bp可見(jiàn)特異性IGF1R目標(biāo)條帶(圖2),干擾細(xì)胞株組中IGFIR的表達(dá)較對(duì)照組明顯減低;經(jīng)灰度掃描及與內(nèi)參照比較分析,干擾細(xì)胞株組IGF1RmRNA的表達(dá)量?jī)H為HEP3B及SMMC7721未干擾組的5%和4%(P<0.05),表明針對(duì)IGF1R的慢病毒PRIME-IGF1R-miR30-shRNA靶向處理能干擾肝癌細(xì)胞株的IGF1RmRNA的表達(dá)。2.4u3000gf1r蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示慢病毒PRIME-IGF1R-miR30-shRNA轉(zhuǎn)染Hep3B和SMMC7721細(xì)胞,48h后,細(xì)胞內(nèi)IGF1R的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,約為對(duì)照組HEP3B和SMMC7721的10%和11%(P<0.05)(圖3)。2.5緩慢病毒1r-mir30-sh氮摧毀對(duì)hep3b和smec7721細(xì)胞的克隆兩組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。2.6兩組ai,smmc9721慢病毒PRIME-IGF1R-miR30-shRNA轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞AI升高,(AI:Hep3B為(39.53±5.33)%),SMMC7721為(31.46±4.23)%;PRIME轉(zhuǎn)染組AI:Hep3B為(11.58±2.9)%,SMMC7721為(10.58±2.63)%。對(duì)照組,SMMC7721AI為(11.78±3.04)%Hep3B為(12.04±3.05)%。實(shí)驗(yàn)組與兩對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。3其他基因組織的藥物作用肝癌基因治療效果與目的基因載體的選擇和基因的轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)。目前以慢病毒作為轉(zhuǎn)基因載體已成為基因治療的熱點(diǎn)。慢病毒載體具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)外源基因;(2)容量大;(3)感染細(xì)胞種類多而且高效,可以感染體內(nèi)、體外分裂細(xì)胞與非分裂細(xì)胞;(4)滴度高;(5)低免疫原性。Ⅰ期臨床表明以重組慢病毒為轉(zhuǎn)基因載體,轉(zhuǎn)入基因不但在人體內(nèi)能有效表達(dá),而且未見(jiàn)野生型慢病毒,故較安全。shRNA是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn),利用慢病毒載體表達(dá)的shRNA在疾病的治療研究中意義更為重要。但載體表達(dá)shRNA的效率直接影響shRNA的干擾效率。常用的polⅢ表達(dá)載體在shRNA的表達(dá)水平、處理效率方面還不十分有效,而miR30天然表達(dá)的效率較高,同時(shí)其前體的處理機(jī)制也比較清楚。pPRIME慢病毒是在miRNA(miR30)主要結(jié)構(gòu)上建立起來(lái)的RNAi載體系統(tǒng),是對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物進(jìn)行基因功能研究、基因治療的,有用工具。在miR30骨架基礎(chǔ)上構(gòu)建的干擾載體比目前通常用的RNAi載體更接近生理情況,可以更有效地發(fā)揮其干擾效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)干擾后的目標(biāo)基因IGF1R在蛋白和mRNA水平上明顯下降。靶基因的選擇是基因治療的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),IGF1R是人1類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF1)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的節(jié)點(diǎn),研究顯示IGF1R在惡性轉(zhuǎn)化具有如下的重要作用:(1)IGF1R在多數(shù)腫瘤及腫瘤細(xì)胞株中顯著過(guò)表達(dá);(2)在IGF1R基因敲除的胎鼠中建立的成纖維細(xì)胞系不能被常見(jiàn)任何一種癌基因中的轉(zhuǎn)化,而重新加入有功能的受體,會(huì)使其對(duì)癌基因的惡性轉(zhuǎn)化作用敏感。IGF1R的轉(zhuǎn)化作用除了促有絲分裂外,很大程度依賴于其抗凋亡作用。實(shí)驗(yàn)顯示在將成纖維細(xì)胞置于大鼠皮下生物擴(kuò)散時(shí),細(xì)胞逐漸凋亡,而過(guò)表達(dá)IGF1R的成纖維細(xì)胞生存時(shí)間顯著延長(zhǎng),IGF1R的數(shù)量水平在細(xì)胞生存中起著決定性作用,只有達(dá)到某一水平,才能將細(xì)胞由不進(jìn)行有絲分裂的模式轉(zhuǎn)化為有絲分裂模式。此外,由于腫瘤缺乏正常的組織結(jié)構(gòu),腫瘤細(xì)胞難以從胞間通訊以及細(xì)胞與胞外基質(zhì)間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中獲得存活信號(hào),須依賴IGF1R介導(dǎo)的RAS/RAF/MEK/MAPK以及STAT3下游通路提供生存信號(hào),因而腫瘤也比正常細(xì)胞更依賴于IGF1R。由于IGF1R在惡性轉(zhuǎn)化中的重要作用,故以IGF1R為靶的治療應(yīng)當(dāng)具有實(shí)用前景。利用RNAi技術(shù)封閉IGF1R的表達(dá),控制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),將會(huì)給肝癌治療提供可靠的手段。本課題組通過(guò)將