人胸苷激酶單克隆抗體的制備及體外免疫反應(yīng)研究

人胸苷激酶單克隆抗體的制備及體外免疫反應(yīng)研究

人類真核細(xì)胞（htk）存在。這是dna合成過程中的一個(gè)重要激酶，與細(xì)胞的分離和復(fù)制密切相關(guān)。hTK有兩種主要同工酶,TK1存在于細(xì)胞質(zhì),而TK2存在于線粒體。研究表明,hTK的升高或減低與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。目前定量檢測(cè)體液中的hTK尚無一個(gè)滿意的方法,研究新型的傳感檢測(cè)技術(shù)對(duì)于hTK的臨床檢測(cè)有重要意義。先前的工作中,我們用DNA重組技術(shù)克隆了hTK基因,且在大腸桿菌中得到了高效表達(dá),重組表達(dá)的hTK用于免疫小鼠制備單克隆抗體。本文在研究了用于hTK檢測(cè)的壓電免疫傳感器的基礎(chǔ)上,對(duì)所制備抗體與hTK的免疫反應(yīng)進(jìn)行更加深入的研究,計(jì)算出該抗原抗體反應(yīng)的親和常數(shù),為進(jìn)一步將該抗體用于hTK的臨床檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料和方法CN3165型高分辨計(jì)數(shù)器(石家莊無線電器廠);石英晶振,AT切割(JA5型),9MHz,兩面鍍金電極,晶片直徑12mm,電極直徑6mm,振蕩電路為本室自制TTL電路。恒溫箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司),蛋白A(北京本元青陽生物科技發(fā)展有限公司),使用時(shí)用磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH7.2)配制成1mg/ml溶液,實(shí)驗(yàn)所用水均為二次蒸餾水。hTK抗原、抗hTK單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備,方法已另文報(bào)道。1.2組裝法ws先將壓電石英晶振用新配制的piranha溶液(3/1濃H2SO4/H2O2)洗滌10min,滴加1mg/ml的蛋白A10μl于金電極上,室溫下自組裝30min,蒸餾水沖洗,磁力攪拌器攪拌下在含0.9%NaCl的PBS中洗5min。蒸餾水沖洗并用氮?dú)獯蹈?滴加1mg/ml抗體10μl,于37℃恒溫箱中反應(yīng)60min,重復(fù)固定蛋白A后的洗滌過程,吹干備用。1.3htk引起的頻移值將固定了蛋白A和抗體的晶振置于檢測(cè)池中(單面與液體接觸),加入180μlPBS,穩(wěn)定后記錄頻率F1,用微量注射器注入20μl一定濃度的hTK,穩(wěn)定后記錄頻率F2,得到該濃度hTK引起的頻移值ΔF(F2-F1)。2結(jié)果2.1蛋白a引起的頻移值蛋白A分子能與金形成非常穩(wěn)定的蛋白A-金復(fù)合物,親和常數(shù)達(dá)108mol/L,在金電極上有強(qiáng)烈吸附現(xiàn)象。因此通過自組裝的方法,蛋白A可在金電極表面形成一層牢固的蛋白A分子層,修飾后的傳感器穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較好。蛋白A在金電極上成膜好壞與自組裝時(shí)間長短有直接關(guān)系,我們測(cè)定了不同固定時(shí)間下蛋白A所引起的頻移值,見表1。由表1可知,自組裝超過20min,晶振頻移值不再隨固定時(shí)間的增加而明顯增加,考慮到實(shí)驗(yàn)中有較多的洗滌步驟,為保證蛋白A與金電極的充分結(jié)合而不易被洗脫,實(shí)驗(yàn)中固定時(shí)間為30min。2.2抗a固定抗體抗體的Fc端能與固定在金電極上的蛋白A特異性結(jié)合,這種結(jié)合能使抗體的活性結(jié)合位點(diǎn)所在的Fab段能裸露在修飾膜的外層而伸向流動(dòng)相,從而不影響抗體與抗原的反應(yīng)活性。這種蛋白A固定的抗體具有幾何定向優(yōu)勢(shì),使石英晶振表面有更多的抗原結(jié)合位點(diǎn),能結(jié)合更多的待測(cè)抗原。固定抗體的濃度直接影響晶振表面的抗體的固定量,進(jìn)而影響傳感器的靈敏度,我們考察了固定抗體的濃度對(duì)抗體固定量的影響,表2是不同濃度的抗體在37℃恒溫箱中反應(yīng)60min所引起的頻移值。從表2中可以看出,在較小濃度時(shí),抗體固定量隨濃度的增加而明顯增大,當(dāng)抗體濃度大于1mg/ml時(shí),頻移值趨于平穩(wěn),抗體固定量增加很小。可以認(rèn)為此時(shí)抗體固定量已達(dá)最大,再增加抗體濃度已無意義,因此實(shí)驗(yàn)中采用1mg/ml的抗體。2.3濃度chtk的關(guān)系曲線將固定了抗體的傳感器分別置于一系列不同濃度的hTK溶液中,測(cè)量其頻移值,得到頻移值(△F)對(duì)hTK濃度(ChTK)的關(guān)系曲線(圖1)。圖1顯示,在較稀濃度時(shí),石英晶體諧振器的頻率變化值隨著hTK濃度的增大而迅速增大,當(dāng)hTK濃度大于40μg/ml時(shí),隨著hTK濃度的增大,晶振頻率不再有明顯變化,這可能是由于空間位阻或者抗體的活性位點(diǎn)達(dá)到飽和的緣故,hTK不能再通過免疫反應(yīng)結(jié)合到晶振上。2.4結(jié)合確定抗體最佳配合比及分子數(shù)之比抗原抗體免疫反應(yīng)結(jié)合常數(shù)的測(cè)量方法,通常是在抗原抗體濃度恒定或其變化條件已知情況下準(zhǔn)確測(cè)定游離和結(jié)合形式的抗原(抗體)濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般用質(zhì)量作用定律推導(dǎo)出的標(biāo)準(zhǔn)Scatchard繪圖法進(jìn)行分析。對(duì)于免疫反應(yīng)可用如下平衡式表示:Ag+Ab→KαAg?AbAg+Ab→ΚαAg-Ab設(shè)A為總的抗原濃度(mol/L),s為抗原的價(jià),sA為總抗原結(jié)合位點(diǎn)總數(shù)(mol/L),B為總的固定抗體濃度(mol/L),n為抗體的價(jià),nB為抗體結(jié)合位點(diǎn)總數(shù)(mol/L),x為結(jié)合抗原的濃度(mol/L)。免疫反應(yīng)平衡時(shí):游離抗原結(jié)合位點(diǎn)(mol/L)=sA-sx游離抗體結(jié)合位點(diǎn)(mol/L)=nB-sx根據(jù)質(zhì)量作用定律,可得Kα=sx/(sA-sx)(nB-sx)(1)令f=x/B,d=A-x則(1)可變換為f/d=Kα(n-sf)(2)為便于Kα的測(cè)定,把(2)式改寫為:1/f=1/nKα·1/d+s/n(3)在抗原抗體反應(yīng)平衡常數(shù)的測(cè)量中,可用頻移值來表征石英晶體表面固定抗體的質(zhì)量和免疫反應(yīng)后結(jié)合抗原的質(zhì)量。再根據(jù)抗原抗體分子量,可得到固定抗體與免疫反應(yīng)結(jié)合抗原的分子數(shù)之比(即摩爾比)。本實(shí)驗(yàn)中:d=A-x(4)f=x/B=△FAg/△FAb·MAb/MAg(5)考慮到這種免疫分析中,當(dāng)抗原濃度較大時(shí),通過免疫反應(yīng)結(jié)合到晶陣表面的抗原相對(duì)于溶液中抗原的總量是比較小的,因而可以忽略免疫反應(yīng)對(duì)溶液中抗原總濃度的影響,把d值近似為A值;抗原分子量為30000,抗體分子量為150000,固定抗體引起的頻移值約為300。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以1/f對(duì)1/d作圖,可得一條高度相關(guān)的直線,見圖2。直線斜率為1/nKα,截距為s/n,由此可求得免疫反應(yīng)結(jié)合常數(shù)Kα。對(duì)直線進(jìn)行線性回歸,可得直線方程斜率為4.73×10-7,截距為0.88,本實(shí)驗(yàn)中,溶液中的hTK作為自由抗原,可將其價(jià)數(shù)視為1,即s=1,根據(jù)截距,可算出抗體的價(jià)數(shù),n=s/0.88=1.14。由于斜率1/nKα等于4.73×10-7,因而Kα=1/(1.14×4.73×10-7)=1.85×106(mol/L)3制備物的質(zhì)量控制免疫親和常數(shù)是確定單克隆抗體性質(zhì)的重要參數(shù)之一,它表示抗原抗體結(jié)合的緊密程度,反映了抗體與抗原分子的一個(gè)決定簇起反應(yīng)的能力,是評(píng)價(jià)抗體活性的重要指標(biāo)。測(cè)定單克隆抗體的親和常數(shù)有許多方法,經(jīng)典的測(cè)定抗體親和常數(shù)的方法是20世紀(jì)50年代左右發(fā)展起來的平衡透析法。該法的全部抗原抗體反應(yīng)過程在均一液相體系中完成,反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程受到的干擾因素較少,基本上完全符合質(zhì)量作用定律的前提條件要求。但該法僅能測(cè)定小分子抗原與相應(yīng)抗體間的親和常數(shù),同時(shí)要求將反應(yīng)底物進(jìn)行放射性標(biāo)記,反應(yīng)完成后又需將抗原抗體復(fù)合物與游離抗原抗體分開,實(shí)驗(yàn)過程繁瑣、復(fù)雜。隨著壓電石英晶體液相振蕩的實(shí)現(xiàn),其具有高靈敏的質(zhì)量響應(yīng)(1Hz/ng)、對(duì)反應(yīng)體系實(shí)時(shí)采樣、進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn),已用于免疫反應(yīng)過程的在線檢測(cè)和免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)將蛋白A吸附于壓電