硼酸半數(shù)致死量實(shí)驗(yàn)

藥物半數(shù)致死量（LD50）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)了解LD50的測(cè)定方法、步驟、計(jì)算過(guò)程，并理解其藥理學(xué)意義。2、了解藥物的濃度與毒性反應(yīng)之間的關(guān)系，為新藥篩選、臨床安全用藥及藥物不良反應(yīng)的監(jiān)測(cè)提供參考。二、方法與步驟實(shí)驗(yàn)藥品：硼酸實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：大白鼠或小白鼠100只器材：電子秤，注射器，灌胃針（16號(hào)），注射器（0.25，1，2，5ml），吸管（0.1，0.2，0.5，1，2，10ml），容量瓶（10，25，50ml），燒杯（10，25，50ml），滴管，外科剪，鑷子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、年齡、性別、生理狀態(tài)、健康及營(yíng)養(yǎng)狀況等亦是影響外源化學(xué)毒性的重要因素，急性毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)也必須認(rèn)真選擇。要求選用初成年的動(dòng)物，用于測(cè)定LD50的動(dòng)物體重大鼠為180-200g/小白鼠18-22g左右，用于實(shí)驗(yàn)的同一批動(dòng)物體重變異不得超過(guò)所用動(dòng)物園平均體重的10%，否則勢(shì)必影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。原則要求雌雄動(dòng)物各半，當(dāng)外源化學(xué)物的毒性有明顯的性別差異時(shí)，則要求選用雌、雄兩種性別的動(dòng)物分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，求出各自的LD50。用于急性毒性實(shí)驗(yàn)的所有動(dòng)物要求是未交配和未受孕的動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行1-2周的檢疫。按規(guī)定大/小鼠每組雌雄5只，經(jīng)選擇后用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物要有明顯的標(biāo)記，以便觀察。經(jīng)口染毒時(shí)，為避免胃內(nèi)容物干擾化學(xué)物的吸收有毒性，染毒前必須禁食，大鼠主要在夜間采食，應(yīng)隔夜禁食，或停食6-8h，染毒后2-4h復(fù)食，禁食時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，因動(dòng)物饑餓也可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼喂環(huán)境環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，飼養(yǎng)室內(nèi)氨濃度對(duì)毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果有重要影響，一般要求室溫控制在22±3℃,飼養(yǎng)密度適當(dāng)，10只大鼠2-3m3，要求無(wú)對(duì)流風(fēng)，人工晝夜（12h白晝，12h黑夜）環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的染毒途徑實(shí)驗(yàn)藥物采用灌服，采用大（?。┦髮Ｓ霉辔羔樆?0-24（16號(hào)注射針）號(hào)腰穿針，抓取動(dòng)物固定成垂直體位，腹部面向操作者，使動(dòng)物上消化道成一直線，大鼠進(jìn)針4-6cm（小鼠進(jìn)針2.5-4cm），灌胃容量1-4ml（小鼠0.2-1ml），特別防止插入氣管。給藥順序：宜采取間隔跳組方法。如共7組，先按2、4、6組順序給藥，然后逆行按7、5、3、1組的順序給藥這樣可避免藥物放置過(guò)久或動(dòng)物饑餓造成的偏向性誤差。而且當(dāng)?shù)?組給藥后，如第2組動(dòng)物已經(jīng)全死，則可省下第1組動(dòng)物及1號(hào)藥液。如第7組已死亡，可補(bǔ)做第8組，爭(zhēng)取做出0﹪死亡率的組來(lái)。注：大、小鼠按體表面積折算的等效劑量比為：大鼠:小鼠=1:73.1小鼠經(jīng)口灌胃給藥方法先保定動(dòng)物,即用右手將小鼠尾巴提起，置于鼠籠或粗糙的平面上，當(dāng)小鼠向前掙扎時(shí)，用左手的拇指和食指捏住小鼠兩耳后頸背皮膚，翻轉(zhuǎn)小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指壓住小鼠尾巴即可。在保定小鼠過(guò)程中，不要用力過(guò)大，勿握其頸部，以免窒息死亡。以灌胃器輕輕壓其頭部，使口腔與食道成一條直線，再將灌胃針沿上腭壁輕輕進(jìn)入食道，當(dāng)灌胃針進(jìn)入約3cm左右時(shí)即達(dá)胃內(nèi)。如果灌胃針的位置插入正確，小鼠可自行吞服藥，灌胃針插入位置不正確，小鼠會(huì)強(qiáng)烈掙扎，必須拔出重插，否則可能將藥物灌入氣管，造成小鼠死亡。注完藥液后輕輕抽出灌胃針。小鼠一次最大灌胃量為：0.4ml/10g.w。3.2大鼠經(jīng)口灌胃給藥方法大鼠的捕捉方法與小鼠基本相同。根據(jù)長(zhǎng)期的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)如用一塊濕的紗布蓋在大鼠身上，既可以防滑，又可以給初學(xué)者一種安全感。為了防止大鼠咬傷，應(yīng)戴上帆布手套。大鼠體型較大，所以不能象保定小鼠那樣可以把尾巴壓住。同樣在保定大鼠時(shí)不能用力過(guò)大和握其頸部，尤其在采取抓握保定大鼠時(shí)，要特別注意。大鼠灌胃的關(guān)鍵是左手把大鼠頭部固定好，使其頭不能隨意擺動(dòng)。其他操作方法與小鼠基本相同。灌胃針進(jìn)入深度為5cm左右。大鼠一次灌胃最大容量2ml/100g.w。注意事項(xiàng)：保定動(dòng)物時(shí)，一定要固定好動(dòng)物，使動(dòng)物頭不要隨意擺動(dòng)，但不能擠捏頸部。灌胃器針頭弧度面向前從動(dòng)物右角處插入，灌胃動(dòng)作要輕柔。不能虐待動(dòng)物，尤其是大鼠，否則，容易被其咬傷。插入灌胃針時(shí)，如果遇到阻力，不能用力繼續(xù)進(jìn)針，應(yīng)停止進(jìn)針，等待其自動(dòng)吞咽時(shí)，迅速進(jìn)針。否則，容易損傷動(dòng)物食道。3．3人中毒臨床表現(xiàn)(1)急性中毒硼酸屬低毒類物質(zhì)，其溶液有弱殺菌能力，少量服用時(shí)呈現(xiàn)和緩的生理作用：大量服用時(shí)可引起休克，損害中樞神經(jīng)。急性中毒多因誤服或經(jīng)破損皮膚吸收引起，通常在48h內(nèi)發(fā)病。主要表現(xiàn)有胃腸道癥狀：惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、嚴(yán)重者嘔吐物中帶血，甚至發(fā)生血便，頻繁腹瀉至脫水、休克：神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；頭暈、頭痛、煩躁不安、亦有患者出現(xiàn)高熱、抽搐、角弓反張，甚至昏迷；肝、腎損害：黃疸、肝功能異常，少尿、無(wú)尿或急性腎功能衰竭；皮膚損害；多數(shù)病例出現(xiàn)皮膚斑點(diǎn)疹，以四肢、足心、手掌、面部、頸部為主，少數(shù)可有剝脫性皮炎；尿硼：含量增高。(2)動(dòng)物慢性中毒實(shí)驗(yàn)表明，硼酸能穿透胎盤，影響雌性動(dòng)物性周期和生育功能，大劑量可導(dǎo)致不育。4、實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程前期準(zhǔn)備：查找資料，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品和飼養(yǎng)場(chǎng)地，熟悉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境包括消毒、溫控、飲水、飼料等，實(shí)驗(yàn)組各人員要熟悉掌握整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，做好實(shí)驗(yàn)前一切準(zhǔn)備。前期準(zhǔn)備：查找資料，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品和飼養(yǎng)場(chǎng)地，熟悉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境包括消毒、溫控、飲水、飼料等，實(shí)驗(yàn)組各人員要熟悉掌握整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，做好實(shí)驗(yàn)前一切準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的購(gòu)買：嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)需要購(gòu)買實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并適應(yīng)飼養(yǎng)一周左右。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的購(gòu)買：嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)需要購(gòu)買實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并適應(yīng)飼養(yǎng)一周左右。預(yù)實(shí)驗(yàn)：預(yù)實(shí)驗(yàn)：按實(shí)驗(yàn)用鼠標(biāo)準(zhǔn)將7大/小鼠分7組，每組2-4只，分別為實(shí)驗(yàn)一組、實(shí)驗(yàn)二組、實(shí)驗(yàn)三組、實(shí)驗(yàn)四組、實(shí)驗(yàn)五組、實(shí)驗(yàn)六組、實(shí)驗(yàn)七組，分別給藥，摸索出0%最高致死量和100%最低致死量，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)正式實(shí)驗(yàn)的劑量和分組。正式實(shí)驗(yàn)：正式實(shí)驗(yàn)：大鼠70只，隨機(jī)分7組→灌服不同濃度的硼酸→按要求記錄組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的活動(dòng)情況。并根據(jù)需要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行剖檢，取材和相應(yīng)的檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)需要從宏觀和微觀方面觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理變化，分析統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)需要從宏觀和微觀方面觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理變化，分析統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則是：各組劑量按等比級(jí)數(shù)；各組動(dòng)物數(shù)相等；大致有一半組數(shù)的動(dòng)物死亡率在10-50%之間，另一半在50-100%之間，最好出現(xiàn)0和100%的劑量組。藥物急性毒性的強(qiáng)度：根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的急性毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（WHO，1977）：ig大、小鼠LD50(mg/kg)，極毒(<1)、劇毒(1-50)中等毒(51-500)低毒(501-5000)實(shí)際無(wú)毒(>5000)。急性毒性實(shí)驗(yàn)一般設(shè)5-7個(gè)劑量組。6、實(shí)驗(yàn)記錄表1急性毒性實(shí)驗(yàn)原始記錄受試物名稱：受試物性狀：受試物來(lái)源：動(dòng)物種屬品系：動(dòng)物來(lái)源及合格證號(hào)：染毒途徑：室溫：日期：劑量組別(mg/kg)動(dòng)物編號(hào)性別體重(g)染毒量(ml)染毒時(shí)間體征及出現(xiàn)時(shí)間死亡時(shí)間體重記錄實(shí)驗(yàn)操作者：實(shí)驗(yàn)記錄者：例表2劑量比值及分組組數(shù)選擇表劑量比值1:kk=0.60.650.70.750.80.850.880.9對(duì)數(shù)劑量差i=-lgki=0.2220.1870.1550.1250.0970.0700.0550.046最高最低致死量相差的倍數(shù)b/a2倍左右---------3-445-66-77-83倍左右---3-444-567-89-10---4倍左右3-44-555-67-89-10------6倍左右4-55-667-89---------9倍左右5-667-88-910---------10倍左右66-789-10------------14倍左右6-778-910------------實(shí)驗(yàn)期限及觀察指標(biāo)急性毒性實(shí)驗(yàn)的觀察期限為7-14d，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)觀察記錄發(fā)生各種中毒癥狀的時(shí)間、癥狀表現(xiàn)程度、發(fā)展過(guò)程、死亡前特征和死亡時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)期間，體重可以反應(yīng)動(dòng)物中毒后的整體變化，一般3-5d測(cè)量體重一次。重點(diǎn)觀察和記錄各個(gè)劑量組動(dòng)物的死亡數(shù)以及每只動(dòng)物的死亡的時(shí)間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時(shí)間，分析中毒的規(guī)律，將對(duì)深入研究該化學(xué)物的毒理機(jī)制給予啟迪。病理學(xué)檢查及其他指標(biāo)：應(yīng)及時(shí)剖檢死亡動(dòng)物，肉眼觀察主要臟器的大小、外觀、色澤、有無(wú)充血、出血、水腫或其他改變，對(duì)有病理變化的組織及臟器應(yīng)做組織病理學(xué)檢查，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各劑量組存活動(dòng)物都應(yīng)做大體病理剖檢，必要時(shí)做組織病理學(xué)檢查。急性毒性試驗(yàn)觀察的動(dòng)物（定性）反應(yīng)指標(biāo)CNS及肌肉神經(jīng)系統(tǒng)：呆滯：對(duì)刺激反應(yīng)遲緩、減弱、消失；不安：對(duì)刺激反應(yīng)過(guò)敏；興奮：強(qiáng)直：行動(dòng)姿勢(shì)改變、叫聲異常、震顫、共濟(jì)失調(diào)。植物神經(jīng)系統(tǒng)：瞳孔縮小、放大：分泌增多如流涎、流淚、出汗。呼吸系統(tǒng)：流涕，呼吸緩慢、困難，潮式呼吸，速率加快，腹式呼吸等。心血管系統(tǒng)：心動(dòng)過(guò)速、緩慢，心律失常，心跳過(guò)強(qiáng)，心跳微弱。消化系統(tǒng)：氣脹，腹瀉，便秘，糞便不成形，黑便等。生殖系統(tǒng)：陰部或乳腺腫脹，污穢分泌物，陰囊下垂，陰莖突出，遺精等。皮毛：皮膚發(fā)紅、充血，紫紺，松弛，皮疹，毛豎起、污穢。眼睛：上瞼下垂，眼球突出，角膜渾濁、充血，有分泌物。其它：肛溫升高、降低，消瘦，拒食等。LD50的計(jì)算當(dāng)實(shí)驗(yàn)的最大劑量死亡率為100%，最小劑量死亡率為0，各組動(dòng)物數(shù)相等，各劑量組的組距等比或劑量對(duì)數(shù)等差時(shí)，用公式一計(jì)算LD50：LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]（公式一）3-Pm-P3-Pm-Pn4LD50=lg-1[Xm-i(∑p-————)]（公式二）4Sx50=i如果Pn<20%或Pm>80%需用校正公式計(jì)算；如Pn>20%或Pm<80%：校正公式：lgLD50＝lgXm－lgi(∑P-)LD50的95%可信限=lg-1(lgLD50±1.96×Sx50)以上各式中：i——組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)劑量之差Xm——最大劑量對(duì)數(shù)P——各劑量組死亡率（死亡率均用小數(shù)表示）Pm——最高死亡率q——各組劑量存活率，q=1-pPn——最低死亡率∑p————各劑量組死亡率之和n——各組動(dòng)物數(shù)Sx50——lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤例表3九靈胃康在小鼠的經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別動(dòng)物數(shù)（n）劑量死亡數(shù)（n）死亡率（p）存活率（q）P·qg/kg對(duì)數(shù)1102.070.316000.01.00.002102.690.429820.20.80.163103.500.544130.30.70.214104.550.658050.50.50.255105.920.772380.80.20.166107.690.8859101.00.00.00i=0.11∑p=2.8以普魯卡因?yàn)槔枋鰧?shí)驗(yàn)過(guò)程1、預(yù)試0和100%估計(jì)致死量（Dn，Dm）小鼠20只，每組4只，10倍稀釋普魯卡因溶液，配制成不同濃度的一系列藥液，在預(yù)試中以0.2ml/10g體重腹腔注射，求出一次給藥后24小時(shí)死亡率為0的最大劑量（Dn）和100%的最小劑量（Dm）分別用0/4與4/4致死量，遞增或遞減一定比例的劑量，找出0和100%死亡劑量的所在范圍選擇合理的劑量分組方案經(jīng)預(yù)試找到Dm和Dn值后，即可在此劑量范圍內(nèi)，按等比級(jí)數(shù)分成5－8個(gè)劑量組，并按下式計(jì)算各組劑量的公比（r或1/k）及分組組數(shù)（N）：公比r或1/k=(N－1)；一般k值多采取0.75－0.85，不宜超過(guò)0.6－0.9。設(shè)本次實(shí)驗(yàn)分為6組，經(jīng)計(jì)算k值為0.837，故各組劑量為Dmk1、Dmk2、Dmk3、Dmk4、Dmk5、Dmk6。在預(yù)實(shí)驗(yàn)所獲得的0和100%致死量范圍內(nèi)，選用幾個(gè)劑量，盡可能使半數(shù)組的死亡率都在50%以上，另半數(shù)組的死亡率都在50%以下。各組動(dòng)物的只數(shù)應(yīng)相等，每組10只，動(dòng)物的體重和性別要均勻分配。完成動(dòng)物分組和劑量計(jì)算后，按組腹腔注射給藥。最好先從中劑量組開(kāi)始，以便能從最初幾組動(dòng)物接受藥物后的反應(yīng)來(lái)判斷兩端的劑量是否合適，否則可隨時(shí)進(jìn)行調(diào)整。隨機(jī)分組選體重20g左右小鼠60只，雌雄兼用，每組10只。雌雄分開(kāi)，分別稱重標(biāo)色，每一檔體重即為一配伍組。于不同部位標(biāo)以顏色（如黃頭、黃背等）根據(jù)隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)分組法將配伍組中的每只小鼠隨機(jī)分配到各組中去。并將各組編號(hào)。同時(shí)可制作色標(biāo)用藥表，如黃頭（20g）用0.4ml，黃背（21g）0.42ml.......，以后無(wú)論何組均按色標(biāo)決定用藥劑量。4、配制等比藥液：低比系列稀釋法本法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，不易出錯(cuò)而且節(jié)省藥物。例：已知 Dmax＝100mg/kg，Dmin＝49mg/kg，r＝0.8387，動(dòng)物體重為20±2g，每組10只，總重為200g，用藥量為0.2ml/10g（腹腔）。一號(hào)藥液濃度＝最高致死量/用藥液量＝100（mg/kg）/20（mg/kg）＝5mg/ml＝0.5%每組藥液量＝每組動(dòng)物總量×用藥液量＝200g×0.02ml/g＝4ml（為留余地本例取5ml）一號(hào)藥液需用量＝每組藥液量/（1－r）＝5ml/（1－0.837）＝30.67ml精確配制0.5%藥液約31ml，從中吸取5ml為一號(hào)液，供第一組用藥。配二號(hào)藥液：在余下的26ml一號(hào)液中生理鹽水5ml，混勻后吸出5ml為二號(hào)液，依次類推，配出一系列比值1：0.837的藥液。5、隨機(jī)確定各組給藥劑量將動(dòng)物組別按甲、乙、丙、丁.......順序排列查閱隨機(jī)數(shù)字表，以隨機(jī)確定各組動(dòng)物的給藥劑量藥液容量均為0.2ml/10g，腹腔注射正式實(shí)驗(yàn)小鼠60只，隨機(jī)分6組→腹腔注射不同濃度的普魯卡因→記錄24h內(nèi)各組10只/組，雌雄各半0.2ml/10g的死亡數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄與分析記錄小白鼠的死亡情況。試驗(yàn)結(jié)果，最大劑量組的反應(yīng)率最好等于或接近100%，最小劑量組的反應(yīng)率最好等于或接近0，若有兩個(gè)劑量出現(xiàn)100%或0的反應(yīng)率時(shí)，須將過(guò)大或過(guò)小的一劑量組剔除。隨后計(jì)算LD50及其95%可信限。以藥物劑量為橫軸，小鼠死亡率為縱軸，在坐標(biāo)紙上繪制普魯卡因劑量與小鼠死亡率曲線。LD50的計(jì)算方法表4改良寇氏法組別動(dòng)物數(shù)(n)劑量(mg/kg)對(duì)數(shù)劑量(X)死亡率(P)死亡率平方110161.002.2070.10.01210179.002.2530.10.01310197.002.2940.30.09410216.002.3340.60.36510238.002.3770.90.81610262.002.418(Xm)1.01.001、Xm:最大劑量組劑量的對(duì)數(shù)值i:相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對(duì)數(shù)P:各組動(dòng)物的死亡率，用小數(shù)表示∑P:各組動(dòng)物死亡率2、Xm=2.413i=0.042∑P=3.000∑P2=1.59273、公式:LD50=lg-1[Xm