硼酸半數(shù)致死量實驗

藥物半數(shù)致死量（LD50）實驗設計實驗目的通過實驗了解LD50的測定方法、步驟、計算過程，并理解其藥理學意義。2、了解藥物的濃度與毒性反應之間的關系，為新藥篩選、臨床安全用藥及藥物不良反應的監(jiān)測提供參考。二、方法與步驟實驗藥品：硼酸實驗動物：大白鼠或小白鼠100只器材：電子秤，注射器，灌胃針（16號），注射器（0.25，1，2，5ml），吸管（0.1，0.2，0.5，1，2，10ml），容量瓶（10，25，50ml），燒杯（10，25，50ml），滴管，外科剪，鑷子等實驗動物的選擇實驗動物的體重、年齡、性別、生理狀態(tài)、健康及營養(yǎng)狀況等亦是影響外源化學毒性的重要因素，急性毒性實驗時也必須認真選擇。要求選用初成年的動物，用于測定LD50的動物體重大鼠為180-200g/小白鼠18-22g左右，用于實驗的同一批動物體重變異不得超過所用動物園平均體重的10%，否則勢必影響實驗結(jié)果的準確性。原則要求雌雄動物各半，當外源化學物的毒性有明顯的性別差異時，則要求選用雌、雄兩種性別的動物分別進行實驗，求出各自的LD50。用于急性毒性實驗的所有動物要求是未交配和未受孕的動物，實驗前應進行1-2周的檢疫。按規(guī)定大/小鼠每組雌雄5只，經(jīng)選擇后用于實驗的動物要有明顯的標記，以便觀察。經(jīng)口染毒時，為避免胃內(nèi)容物干擾化學物的吸收有毒性，染毒前必須禁食，大鼠主要在夜間采食，應隔夜禁食，或停食6-8h，染毒后2-4h復食，禁食時間不宜過長，因動物饑餓也可影響實驗結(jié)果。實驗動物的飼喂環(huán)境環(huán)境因素對實驗結(jié)果影響很大，飼養(yǎng)室內(nèi)氨濃度對毒性實驗結(jié)果有重要影響，一般要求室溫控制在22±3℃,飼養(yǎng)密度適當，10只大鼠2-3m3，要求無對流風，人工晝夜（12h白晝，12h黑夜）環(huán)境。實驗動物的染毒途徑實驗藥物采用灌服，采用大（?。┦髮Ｓ霉辔羔樆?0-24（16號注射針）號腰穿針，抓取動物固定成垂直體位，腹部面向操作者，使動物上消化道成一直線，大鼠進針4-6cm（小鼠進針2.5-4cm），灌胃容量1-4ml（小鼠0.2-1ml），特別防止插入氣管。給藥順序：宜采取間隔跳組方法。如共7組，先按2、4、6組順序給藥，然后逆行按7、5、3、1組的順序給藥這樣可避免藥物放置過久或動物饑餓造成的偏向性誤差。而且當?shù)?組給藥后，如第2組動物已經(jīng)全死，則可省下第1組動物及1號藥液。如第7組已死亡，可補做第8組，爭取做出0﹪死亡率的組來。注：大、小鼠按體表面積折算的等效劑量比為：大鼠:小鼠=1:73.1小鼠經(jīng)口灌胃給藥方法先保定動物,即用右手將小鼠尾巴提起，置于鼠籠或粗糙的平面上，當小鼠向前掙扎時，用左手的拇指和食指捏住小鼠兩耳后頸背皮膚，翻轉(zhuǎn)小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指壓住小鼠尾巴即可。在保定小鼠過程中，不要用力過大，勿握其頸部，以免窒息死亡。以灌胃器輕輕壓其頭部，使口腔與食道成一條直線，再將灌胃針沿上腭壁輕輕進入食道，當灌胃針進入約3cm左右時即達胃內(nèi)。如果灌胃針的位置插入正確，小鼠可自行吞服藥，灌胃針插入位置不正確，小鼠會強烈掙扎，必須拔出重插，否則可能將藥物灌入氣管，造成小鼠死亡。注完藥液后輕輕抽出灌胃針。小鼠一次最大灌胃量為：0.4ml/10g.w。3.2大鼠經(jīng)口灌胃給藥方法大鼠的捕捉方法與小鼠基本相同。根據(jù)長期的實踐經(jīng)驗，我們發(fā)現(xiàn)如用一塊濕的紗布蓋在大鼠身上，既可以防滑，又可以給初學者一種安全感。為了防止大鼠咬傷，應戴上帆布手套。大鼠體型較大，所以不能象保定小鼠那樣可以把尾巴壓住。同樣在保定大鼠時不能用力過大和握其頸部，尤其在采取抓握保定大鼠時，要特別注意。大鼠灌胃的關鍵是左手把大鼠頭部固定好，使其頭不能隨意擺動。其他操作方法與小鼠基本相同。灌胃針進入深度為5cm左右。大鼠一次灌胃最大容量2ml/100g.w。注意事項：保定動物時，一定要固定好動物，使動物頭不要隨意擺動，但不能擠捏頸部。灌胃器針頭弧度面向前從動物右角處插入，灌胃動作要輕柔。不能虐待動物，尤其是大鼠，否則，容易被其咬傷。插入灌胃針時，如果遇到阻力，不能用力繼續(xù)進針，應停止進針，等待其自動吞咽時，迅速進針。否則，容易損傷動物食道。3．3人中毒臨床表現(xiàn)(1)急性中毒硼酸屬低毒類物質(zhì)，其溶液有弱殺菌能力，少量服用時呈現(xiàn)和緩的生理作用：大量服用時可引起休克，損害中樞神經(jīng)。急性中毒多因誤服或經(jīng)破損皮膚吸收引起，通常在48h內(nèi)發(fā)病。主要表現(xiàn)有胃腸道癥狀：惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、嚴重者嘔吐物中帶血，甚至發(fā)生血便，頻繁腹瀉至脫水、休克：神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；頭暈、頭痛、煩躁不安、亦有患者出現(xiàn)高熱、抽搐、角弓反張，甚至昏迷；肝、腎損害：黃疸、肝功能異常，少尿、無尿或急性腎功能衰竭；皮膚損害；多數(shù)病例出現(xiàn)皮膚斑點疹，以四肢、足心、手掌、面部、頸部為主，少數(shù)可有剝脫性皮炎；尿硼：含量增高。(2)動物慢性中毒實驗表明，硼酸能穿透胎盤，影響雌性動物性周期和生育功能，大劑量可導致不育。4、實驗流程實驗流程前期準備：查找資料，準備實驗用品和飼養(yǎng)場地，熟悉實驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境包括消毒、溫控、飲水、飼料等，實驗組各人員要熟悉掌握整個實驗過程，做好實驗前一切準備。前期準備：查找資料，準備實驗用品和飼養(yǎng)場地，熟悉實驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境包括消毒、溫控、飲水、飼料等，實驗組各人員要熟悉掌握整個實驗過程，做好實驗前一切準備。實驗動物的購買：嚴格按照實驗需要購買實驗動物，并適應飼養(yǎng)一周左右。實驗動物的購買：嚴格按照實驗需要購買實驗動物，并適應飼養(yǎng)一周左右。預實驗：預實驗：按實驗用鼠標準將7大/小鼠分7組，每組2-4只，分別為實驗一組、實驗二組、實驗三組、實驗四組、實驗五組、實驗六組、實驗七組，分別給藥，摸索出0%最高致死量和100%最低致死量，以此為依據(jù)設計正式實驗的劑量和分組。正式實驗：正式實驗：大鼠70只，隨機分7組→灌服不同濃度的硼酸→按要求記錄組實驗動物的活動情況。并根據(jù)需要對實驗動物進行剖檢，取材和相應的檢驗。實驗結(jié)果：根據(jù)需要從宏觀和微觀方面觀察實驗動物的病理變化，分析統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，撰寫實驗報告。實驗結(jié)果：根據(jù)需要從宏觀和微觀方面觀察實驗動物的病理變化，分析統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，撰寫實驗報告。實驗設計的原則是：各組劑量按等比級數(shù)；各組動物數(shù)相等；大致有一半組數(shù)的動物死亡率在10-50%之間，另一半在50-100%之間，最好出現(xiàn)0和100%的劑量組。藥物急性毒性的強度：根據(jù)化學物質(zhì)的急性毒性的分級標準（WHO，1977）：ig大、小鼠LD50(mg/kg)，極毒(<1)、劇毒(1-50)中等毒(51-500)低毒(501-5000)實際無毒(>5000)。急性毒性實驗一般設5-7個劑量組。6、實驗記錄表1急性毒性實驗原始記錄受試物名稱：受試物性狀：受試物來源：動物種屬品系：動物來源及合格證號：染毒途徑：室溫：日期：劑量組別(mg/kg)動物編號性別體重(g)染毒量(ml)染毒時間體征及出現(xiàn)時間死亡時間體重記錄實驗操作者：實驗記錄者：例表2劑量比值及分組組數(shù)選擇表劑量比值1:kk=0.60.650.70.750.80.850.880.9對數(shù)劑量差i=-lgki=0.2220.1870.1550.1250.0970.0700.0550.046最高最低致死量相差的倍數(shù)b/a2倍左右---------3-445-66-77-83倍左右---3-444-567-89-10---4倍左右3-44-555-67-89-10------6倍左右4-55-667-89---------9倍左右5-667-88-910---------10倍左右66-789-10------------14倍左右6-778-910------------實驗期限及觀察指標急性毒性實驗的觀察期限為7-14d，實驗中應觀察記錄發(fā)生各種中毒癥狀的時間、癥狀表現(xiàn)程度、發(fā)展過程、死亡前特征和死亡時間等。實驗期間，體重可以反應動物中毒后的整體變化，一般3-5d測量體重一次。重點觀察和記錄各個劑量組動物的死亡數(shù)以及每只動物的死亡的時間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時間，分析中毒的規(guī)律，將對深入研究該化學物的毒理機制給予啟迪。病理學檢查及其他指標：應及時剖檢死亡動物，肉眼觀察主要臟器的大小、外觀、色澤、有無充血、出血、水腫或其他改變，對有病理變化的組織及臟器應做組織病理學檢查，實驗結(jié)束后，對各劑量組存活動物都應做大體病理剖檢，必要時做組織病理學檢查。急性毒性試驗觀察的動物（定性）反應指標CNS及肌肉神經(jīng)系統(tǒng)：呆滯：對刺激反應遲緩、減弱、消失；不安：對刺激反應過敏；興奮：強直：行動姿勢改變、叫聲異常、震顫、共濟失調(diào)。植物神經(jīng)系統(tǒng)：瞳孔縮小、放大：分泌增多如流涎、流淚、出汗。呼吸系統(tǒng)：流涕，呼吸緩慢、困難，潮式呼吸，速率加快，腹式呼吸等。心血管系統(tǒng)：心動過速、緩慢，心律失常，心跳過強，心跳微弱。消化系統(tǒng)：氣脹，腹瀉，便秘，糞便不成形，黑便等。生殖系統(tǒng)：陰部或乳腺腫脹，污穢分泌物，陰囊下垂，陰莖突出，遺精等。皮毛：皮膚發(fā)紅、充血，紫紺，松弛，皮疹，毛豎起、污穢。眼睛：上瞼下垂，眼球突出，角膜渾濁、充血，有分泌物。其它：肛溫升高、降低，消瘦，拒食等。LD50的計算當實驗的最大劑量死亡率為100%，最小劑量死亡率為0，各組動物數(shù)相等，各劑量組的組距等比或劑量對數(shù)等差時，用公式一計算LD50：LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]（公式一）3-Pm-P3-Pm-Pn4LD50=lg-1[Xm-i(∑p-————)]（公式二）4Sx50=i如果Pn<20%或Pm>80%需用校正公式計算；如Pn>20%或Pm<80%：校正公式：lgLD50＝lgXm－lgi(∑P-)LD50的95%可信限=lg-1(lgLD50±1.96×Sx50)以上各式中：i——組距，即相鄰兩組劑量對數(shù)劑量之差Xm——最大劑量對數(shù)P——各劑量組死亡率（死亡率均用小數(shù)表示）Pm——最高死亡率q——各組劑量存活率，q=1-pPn——最低死亡率∑p————各劑量組死亡率之和n——各組動物數(shù)Sx50——lgLD50的標準誤例表3九靈胃康在小鼠的經(jīng)口急性毒性實驗結(jié)果組別動物數(shù)（n）劑量死亡數(shù)（n）死亡率（p）存活率（q）P·qg/kg對數(shù)1102.070.316000.01.00.002102.690.429820.20.80.163103.500.544130.30.70.214104.550.658050.50.50.255105.920.772380.80.20.166107.690.8859101.00.00.00i=0.11∑p=2.8以普魯卡因為例描述實驗過程1、預試0和100%估計致死量（Dn，Dm）小鼠20只，每組4只，10倍稀釋普魯卡因溶液，配制成不同濃度的一系列藥液，在預試中以0.2ml/10g體重腹腔注射，求出一次給藥后24小時死亡率為0的最大劑量（Dn）和100%的最小劑量（Dm）分別用0/4與4/4致死量，遞增或遞減一定比例的劑量，找出0和100%死亡劑量的所在范圍選擇合理的劑量分組方案經(jīng)預試找到Dm和Dn值后，即可在此劑量范圍內(nèi)，按等比級數(shù)分成5－8個劑量組，并按下式計算各組劑量的公比（r或1/k）及分組組數(shù)（N）：公比r或1/k=(N－1)；一般k值多采取0.75－0.85，不宜超過0.6－0.9。設本次實驗分為6組，經(jīng)計算k值為0.837，故各組劑量為Dmk1、Dmk2、Dmk3、Dmk4、Dmk5、Dmk6。在預實驗所獲得的0和100%致死量范圍內(nèi)，選用幾個劑量，盡可能使半數(shù)組的死亡率都在50%以上，另半數(shù)組的死亡率都在50%以下。各組動物的只數(shù)應相等，每組10只，動物的體重和性別要均勻分配。完成動物分組和劑量計算后，按組腹腔注射給藥。最好先從中劑量組開始，以便能從最初幾組動物接受藥物后的反應來判斷兩端的劑量是否合適，否則可隨時進行調(diào)整。隨機分組選體重20g左右小鼠60只，雌雄兼用，每組10只。雌雄分開，分別稱重標色，每一檔體重即為一配伍組。于不同部位標以顏色（如黃頭、黃背等）根據(jù)隨機單位組設計分組法將配伍組中的每只小鼠隨機分配到各組中去。并將各組編號。同時可制作色標用藥表，如黃頭（20g）用0.4ml，黃背（21g）0.42ml.......，以后無論何組均按色標決定用藥劑量。4、配制等比藥液：低比系列稀釋法本法簡便、快捷、準確，不易出錯而且節(jié)省藥物。例：已知 Dmax＝100mg/kg，Dmin＝49mg/kg，r＝0.8387，動物體重為20±2g，每組10只，總重為200g，用藥量為0.2ml/10g（腹腔）。一號藥液濃度＝最高致死量/用藥液量＝100（mg/kg）/20（mg/kg）＝5mg/ml＝0.5%每組藥液量＝每組動物總量×用藥液量＝200g×0.02ml/g＝4ml（為留余地本例取5ml）一號藥液需用量＝每組藥液量/（1－r）＝5ml/（1－0.837）＝30.67ml精確配制0.5%藥液約31ml，從中吸取5ml為一號液，供第一組用藥。配二號藥液：在余下的26ml一號液中生理鹽水5ml，混勻后吸出5ml為二號液，依次類推，配出一系列比值1：0.837的藥液。5、隨機確定各組給藥劑量將動物組別按甲、乙、丙、丁.......順序排列查閱隨機數(shù)字表，以隨機確定各組動物的給藥劑量藥液容量均為0.2ml/10g，腹腔注射正式實驗小鼠60只，隨機分6組→腹腔注射不同濃度的普魯卡因→記錄24h內(nèi)各組10只/組，雌雄各半0.2ml/10g的死亡數(shù)。實驗結(jié)果記錄與分析記錄小白鼠的死亡情況。試驗結(jié)果，最大劑量組的反應率最好等于或接近100%，最小劑量組的反應率最好等于或接近0，若有兩個劑量出現(xiàn)100%或0的反應率時，須將過大或過小的一劑量組剔除。隨后計算LD50及其95%可信限。以藥物劑量為橫軸，小鼠死亡率為縱軸，在坐標紙上繪制普魯卡因劑量與小鼠死亡率曲線。LD50的計算方法表4改良寇氏法組別動物數(shù)(n)劑量(mg/kg)對數(shù)劑量(X)死亡率(P)死亡率平方110161.002.2070.10.01210179.002.2530.10.01310197.002.2940.30.09410216.002.3340.60.36510238.002.3770.90.81610262.002.418(Xm)1.01.001、Xm:最大劑量組劑量的對數(shù)值i:相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對數(shù)P:各組動物的死亡率，用小數(shù)表示∑P:各組動物死亡率2、Xm=2.413i=0.042∑P=3.000∑P2=1.59273、公式:LD50=lg-1[Xm