毒理學(xué)基礎(chǔ)試驗指導(dǎo)

衛(wèi)生毒理學(xué)實驗指導(dǎo)編寫：陳秉符古雅2009年3月實驗一毒理學(xué)實驗設(shè)計 錯誤!未定義書簽。實驗二實驗動物的一般操作技術(shù) 錯誤!未定義書簽。實驗三滅多威經(jīng)口急性毒性試驗 錯誤!未定義書簽。實驗四苯經(jīng)呼吸道急性毒性試驗 錯誤!未定義書簽。實驗五蓄積毒性試驗 錯誤!未定義書簽。實驗六亞慢性和慢性毒性試驗 錯誤!未定義書簽。實驗七小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 錯誤!未定義書簽。實驗八小鼠精子畸形試驗 錯誤!未定義書簽。實驗九骨髓細(xì)胞染色體畸變分析 錯誤!未定義書簽。實驗十鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變試驗 錯誤!未定義書簽。實驗十一致畸試驗及胚胎胎仔檢查方法 錯誤!未定義書簽。實驗十二網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù) 錯誤!未定義書簽。附錄：動物實驗報告的撰寫及注意事項 錯誤!未定義書簽。實驗一毒理學(xué)實驗設(shè)計一、目的和意義毒理學(xué)的很多研究工作需要通過動物實驗來進(jìn)行。使用實驗動物進(jìn)行科研的優(yōu)點是花費人力、物力較少，時間短，易發(fā)現(xiàn)單因素與結(jié)果的關(guān)系，能提供大量有價值的可與人類生命活動現(xiàn)象相類比的資料。在毒理學(xué)實驗研究中，健康的實驗動物是保證工作順利進(jìn)行和獲得正確可靠的研究結(jié)果的重要條件。毒理學(xué)研究外源化學(xué)物對于機體（特別是人體）的有害作用及其機制。毒理學(xué)研究的主要手段是動物實驗。體內(nèi)試驗是以實驗動物為模型，最終目的是通過外源化學(xué)物對實驗動物的毒性反應(yīng)，向人（原型）外推，以期評估外源化學(xué)物對人的危害及危險性。體外實驗主要用于篩選和預(yù)測急性毒性和機制研究；人體實驗和流行病學(xué)調(diào)查則可進(jìn)一步深化和證實在動物實驗中所得到的資料。實際上，毒理學(xué)作為一門實驗科學(xué)是以動物實驗為中心的，毒理學(xué)動物實驗的設(shè)計、實施、結(jié)果觀察和評價是毒理學(xué)研究的基本方法。通過本次討論，要求學(xué)生基本掌握毒理學(xué)實驗設(shè)計的原則和方法。二、內(nèi)容（一）毒理學(xué)實驗的原則和局限性1、毒理學(xué)實驗的原則在毒理學(xué)的試驗中，有三個基本的原則。第一個原則，化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人。第二個原則，實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可靠的方法。第三個原則，成年健康（雄性和雌性未孕）的實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。2、毒理學(xué)實驗的局限性用實驗動物的毒理學(xué)實驗資料外推到人群接觸的安全性時，會有很大的不確定性。（二）毒理學(xué)常規(guī)毒性試驗的基本目的毒性評價或安全性評價方面的基本目的包括以下幾點：.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。.劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）研究。.確定毒作用的靶器官。.確定損害的可逆性。毒理學(xué)研究還可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感檢測指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志、毒作用機制研究、受試物的毒物動力學(xué)和代謝研究、中毒的解救措施等。對這些要求，應(yīng)擴(kuò)展常規(guī)試驗的設(shè)計以包括有關(guān)的項目，或者另外設(shè)計和進(jìn)行靶器官毒理學(xué)研究及機制毒理學(xué)研究。（三）實驗動物的選擇毒理學(xué)的動物實驗是以實驗動物作為研究對象的，為獲得可靠的研究結(jié)果，先決條件是正確地選用實驗動物。1、實驗動物物種的選擇對實驗動物物種選擇的基本原則是：選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物

種。在毒理學(xué)研究中常用的實驗動物物種如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實驗動物有地鼠、獼猴、小型豬、雞等。常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)見表1-1。以上實驗動物各物種中，實際上沒有一種完全符合上述物種選擇的原則，目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是狗。豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗，兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗。遺傳毒理學(xué)試驗多用小鼠，致癌試驗常用大鼠和小鼠，致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔。遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。表1-1常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)參數(shù)猴狗貓兔 大 鼠 小鼠豚鼠地鼠成體體重(kg)壽命(a)1615146331水消耗(ml/d)45035032030035614530飼料消耗(成本g/d)1504001001801051210成體代謝cal/kgd)1588080110130600100250體溫(℃)39l438l2呼吸頻率50202553851609083(次/min)(40?60)(10?30)(20?30)(40?65)(65?110)(80?240)(70?100)(35?130)心率(次/min)200100120200328600300450血壓mmHg159/127148/100155/100110/80130/90120/7577/50108/77(收縮/舒張)出生體重(g)500?700110(?22001251005-675?100斷乳時體重(g)440058003000100?150040?5010?1225035開眼(d)出生當(dāng)天8?128?121010?1211出生當(dāng)天15妊娠(d)16863633121206716性周期(d)282215?2815?164?54?516?194動情期(d)1?27?139?19301111窩數(shù)量13?61?61?136?91?121?51?12斷乳年齡(周)16?2466?983?4323?4生殖年齡(月)549106?72?3232生殖期(年)10?155?1041?31131生殖季節(jié)任何時間春，秋冬季2?3個月任何時間任何時間任何時間任何時間任何時間所需面積(tf2)*6833環(huán)境溫度(℃)18?2818?2818?2818?2819?2519?2519?2519?25血容量(ML/Kg)7579605365807585凝血時間(s)90180120300601460143HCT(%紅細(xì)胞)4245404246414250Hb(g/bl)2、實驗動物品系的選擇品系(strain)是實驗動物學(xué)的專用名詞，指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。實驗動物按遺傳學(xué)控制分類可分為：①近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。如小鼠有津白I、津白H、615,DBA/1和DBA/2,BALB/C,C3H,C57B/6J,A和A/He等。②雜交群動物(雜交1代，F(xiàn)1),指兩個不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動物。③封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機交配繁殖的動物群。如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實驗動物對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)有差別，所以毒理學(xué)研究要選擇適宜的品系，對某種外源化學(xué)物毒理學(xué)系列研究中應(yīng)固定使用同一品系動物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。遺傳毒理學(xué)一般利用嚙齒類動物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由，其他物種也可接受。有的文獻(xiàn)報告在小鼠骨髓微核試驗MS/Ae品系比ddy,CD-1或BDF品系更敏感。但一般認(rèn)為還沒能證明某一品系對所有的遺傳毒性物質(zhì)比其他品系都敏感。在致癌試驗中對實驗動物的品系有一定的要求，特別重視有關(guān)病理損害的自發(fā)發(fā)生率。3、對實驗動物微生物控制的選擇按微生物控制分類，實驗動物分為四級，見表1-2。對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動物，以保證實驗結(jié)果的可靠性。表1-2 實驗動物微生物等級級別 要 求I級 普通動物，應(yīng)沒有傳染給人的疾病II級 清潔動物，除I級標(biāo)準(zhǔn)外，種系清楚，沒有該動物特有的疾病III級 無特定病原體動物(SPF),除I級標(biāo)準(zhǔn)外，動物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖，在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng)，可有不致病細(xì)菌叢，沒有致病病原體IV級 無菌動物，在全封閉無菌條件下飼養(yǎng)的純系動物，動物體外不帶有任何微生物和寄生蟲(包括絕大部分病毒)4、個體選擇實驗動物對外來化學(xué)物的毒性反應(yīng)還存在個體差異，應(yīng)注意實驗動物的個體選擇。.性別同一物種、同一品系的實驗動物雌雄兩性通常對相同外源化學(xué)物毒性反應(yīng)類似但雌雄兩性對化學(xué)物的毒性敏感性上存在著差別。如果已知不同性別的動物對受試物敏感性不同，應(yīng)選擇敏感的性別。如對性別差異不清楚，則應(yīng)選用雌雄兩種性別。如實驗中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應(yīng)將不同性別動物的實驗結(jié)果分別統(tǒng)計分析。在遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗中，對性別的選擇有幾種意見：①對單個物種應(yīng)用兩種性別。②對單個物種應(yīng)用兩種性別，除非已在一個性別得到陽性反應(yīng)，就不必對另一種性別進(jìn)行試驗。③對單個物種應(yīng)用兩種性別，除非經(jīng)毒代動力學(xué)研究證明受試物和其代謝產(chǎn)物)在雄性和雌性無差別和/或如果在確定劑量的預(yù)試驗證明有相等毒性。此假定在非遺傳毒性與遺傳毒性之間有相關(guān)。④對單個物種常規(guī)用一種性另IJ(雄性或雌性)，除非預(yù)期/證明存在性別差異。由于歷史的原因UDS體內(nèi)/體外試驗常規(guī)用雄性大鼠。一般來說，對于初次試驗的受試物，應(yīng)該采用兩種性別。對大鼠和小鼠各一種性別進(jìn)行試驗可能比單個物種兩種性別提供更好的危害鑒定，但這需要更多的資料來證明。.年齡和體重.生理狀態(tài).健康狀況（四）毒理學(xué)試驗設(shè)計要點1、體內(nèi)試驗設(shè)計.劑量分組在毒理學(xué)試驗中，最重要的就是研究劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，也就是當(dāng)外源化學(xué)物染毒劑量增加，實驗動物的毒性反應(yīng)（效應(yīng)）隨之而增強。劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系的存在是確定外源化學(xué)物與有害作用的因果關(guān)系的重要依據(jù)，也可證明實驗結(jié)果的可靠性。因此，在毒理學(xué)試驗中，一般至少要設(shè)3個劑量組（即高劑量組、中劑量組、低劑量組），希望能得到滿意的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系。特別注意設(shè)立對照組：未處理對照組（以前有稱為空白對照組）：陰性（溶劑/賦形劑）對照：③陽性對照：④歷史性對照：.各組動物數(shù).試驗期限2、體外試驗設(shè)計.測定受試物溶解性.試驗最高劑量的推薦.代謝活化.陽性對照.重復(fù)（五）實驗動物的染毒和處置1、動物實驗前的準(zhǔn)備2、受試物和樣品的準(zhǔn)備3、染毒途徑4、實驗動物處死及生物標(biāo)本采集.實驗動物處死方法.血液采集.尿液采集.病理解剖、標(biāo)本留取和組織病理學(xué)檢查（六）實驗結(jié)果處理和分析在毒理學(xué)試驗的設(shè)計和實施中應(yīng)貫徹實驗設(shè)計的對照、隨機和重復(fù)的原則，實驗的各劑量組所得到的結(jié)果應(yīng)與陰性對照組比較。根據(jù)實驗結(jié)果（指標(biāo)）的變量類型是數(shù)值變量（計量資料）還是分類變量（計數(shù)資料），選用不同的統(tǒng)計分析方法。在評價毒理學(xué)試驗的結(jié)果時，應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計檢驗的假設(shè)是關(guān)于總體特征的假設(shè)，檢驗方法是以統(tǒng)計量的抽樣分布為根據(jù)的，得到的結(jié)論是概率性的，不是絕對的肯定或否定，不等同于有或無生物學(xué)意義。對實驗結(jié)果作出科學(xué)的判斷和解釋，應(yīng)該根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果、生物學(xué)知識和經(jīng)驗。1、毒理學(xué)試驗的統(tǒng)計學(xué)統(tǒng)計學(xué)觀點及方法在毒理學(xué)試驗的設(shè)計和結(jié)果評價中起關(guān)鍵的作用，毒理學(xué)試驗的發(fā)展也促進(jìn)了生物統(tǒng)計學(xué)的發(fā)展。毒理學(xué)試驗統(tǒng)計學(xué)評價的主要進(jìn)展是劑量一反應(yīng)關(guān)系研究和對超離差數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。1).毒理學(xué)試驗設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)要求毒理學(xué)試驗的設(shè)計應(yīng)遵循隨機、重復(fù)及對照三個原則，要求各觀察值具有代表性，并且是相互獨立的。毒理學(xué)試驗的設(shè)計具體涉及到劑量水平數(shù)目及間隔，每個劑量點的實驗單位數(shù)，每個實驗單位接種及計數(shù)的細(xì)胞數(shù)，對照組的設(shè)置等。實驗單位的確定對于樣品的獨立性是很重要的，實驗單位(experimentalunit)是進(jìn)行處理時或觀察時獨立的最大采樣單位。以動物和培養(yǎng)物作為實驗單位要比以細(xì)胞作為實驗單位更為可取。此外，如果同時評價幾個不同因素的效應(yīng)，應(yīng)注意均衡的原則，實驗設(shè)計應(yīng)可以區(qū)分不同因素的貢獻(xiàn)并分別估計。樣本的代表性要求具有同質(zhì)性，即各處理組和對照組的非實驗因素的條件均一致，為此，各實驗單位(動物或培養(yǎng)物)的分組及整個實驗的全部操作都應(yīng)遵循隨機化原則。在利用形態(tài)學(xué)指標(biāo)的毒理學(xué)試驗，必須采用盲法觀察結(jié)果，以消除實驗者觀察結(jié)果的偏性。樣本應(yīng)有足夠的大小和適當(dāng)?shù)闹貜?fù)次數(shù)，以估計處理之間、實驗室內(nèi)和實驗室間的變異性。一般可根據(jù)顯著性水準(zhǔn)、檢驗把握度、容許誤差、總體標(biāo)準(zhǔn)差等來估計樣本的大小。嚴(yán)格執(zhí)行毒理學(xué)試驗設(shè)計的上述要求，才可能得到可靠性和重復(fù)性良好的結(jié)果，也是進(jìn)行正確的統(tǒng)計學(xué)評價的基礎(chǔ)。良好的質(zhì)量保證和實驗設(shè)計可以監(jiān)控系統(tǒng)誤差，而統(tǒng)計處理則用來確定隨機誤差。毒理學(xué)試驗的數(shù)據(jù)通常是由劑量水平和相應(yīng)觀察值組成的二維關(guān)系型數(shù)據(jù)。毒理學(xué)試驗處理組與陰性對照組觀察值均數(shù)的比較，如果資料可擬合某種分布，則適用于參數(shù)檢驗，其敏感度和效率高于非參數(shù)檢驗；如資料不能擬合某些已知的分布，則應(yīng)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，以滿足正態(tài)性和方差齊性。如果任何變換都不能改善數(shù)據(jù)的分布，可能存在個別可疑值，應(yīng)予以識別和剔除。另一方面，可使用不依賴總體分布模型的非參數(shù)統(tǒng)計分析。一種毒理學(xué)試驗資料可以有若干種正確的統(tǒng)計學(xué)分析方法，但可能不存在唯一正確的方法。其原因主要是表面上不同的統(tǒng)計學(xué)分析方法常以相同的統(tǒng)計學(xué)概念和模型為基礎(chǔ)。另一方面，利用不同的統(tǒng)計學(xué)方法來評價毒理學(xué)試驗資料缺乏比較研究。.各處理組與陰性對照組兩兩比較和多個處理組與陰性對照組比較各處理組與陰性對照組兩兩比較和多個處理組與陰性對照組比較常用的統(tǒng)計學(xué)方法見表1-3。表1-3各處理組與陰性對照組兩兩比較和多個比較的統(tǒng)計學(xué)方法類型連續(xù)性數(shù)據(jù)，方差齊正態(tài)分布方差不齊離散性數(shù)據(jù)分布未知二項分布泊松分布處理組與陰卡方檢驗，F(xiàn)isheru檢驗非參數(shù)法，如性對照組兩t檢驗t/檢驗確切概率法，u檢Wilcoxon秩和兩比較驗檢驗多個處理組與陰性對照組比較Dunnett檢驗(1955)改進(jìn)的DUNnett檢驗(1980)平方根反正弦轉(zhuǎn)換，再用dunnett檢驗，或者Simes法(1986)Suissa和Salmi法(1989)非參數(shù)法，如多重比較秩和檢驗(Steel，1959).劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系是毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容。在急性毒性化與0)研究中，就是典型的劑量-反應(yīng)關(guān)系研究，ld50是統(tǒng)計學(xué)的點值估計和區(qū)間估計。在其他毒理學(xué)試驗中的陽性劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)的確定也應(yīng)通過統(tǒng)計學(xué)處理和判定，盡管，可以用各處理組與陰性對照組兩兩比較和各處理組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)高劑量組與中、低劑量組及對照組間差別有顯著性，中劑量組與低劑量組和對照組間差別有顯著性，低劑量組與對照組間差別無顯著性，來證明有劑量-反應(yīng)關(guān)系；但這種方法的效率較低。劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)的判定可以分為定性和定量統(tǒng)計學(xué)兩大類。劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系的統(tǒng)計學(xué)定性分析即為趨勢檢驗，而統(tǒng)計學(xué)定量分析則為模型擬合。趨勢檢驗是檢驗對自變量“規(guī)定的水平，反應(yīng)的觀察值增高或降低的趨勢的顯著性。當(dāng)自變量s為定量數(shù)據(jù)時，則可進(jìn)行模型擬合，即劑量反應(yīng)關(guān)系的定量研究。趨勢試驗(trendtesting),劑量為xi；反應(yīng)為巴，當(dāng)有x0<x1<???<xK，無效假設(shè)為H0：u=u0=...=uk備擇假設(shè)為Ha：巴W%W…?乙或巴三乙三…三八單調(diào)上升或單調(diào)下降趨勢。如反應(yīng)巴為連續(xù)資料服從正態(tài)分布，當(dāng)xi為定量數(shù)據(jù)，則可選用簡單的線性回歸或加權(quán)線性回歸；如反應(yīng)巴為離散資料服從二項分布或泊松分布，可選用Cochran-Armitage趨勢檢驗；如果樣本所屬的總體分布未知，則可利用非參數(shù)法加Jonckheere-Terstra趨勢檢驗(Jonckheere,1954)。在毒理學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)方法中最主要的發(fā)展是劑量-反應(yīng)關(guān)系的統(tǒng)計學(xué)方法、超離差(overdispersion)計數(shù)資料的統(tǒng)計學(xué)方法及廣義線性模型(generalizedlinearmodel)。這些方法，可以利用統(tǒng)計程序包如SAS,Genstat等來實現(xiàn)。.對常規(guī)毒理學(xué)試驗資料推薦的統(tǒng)計學(xué)方^Cad等，1994)A體重和器官重量：體重常是毒性效應(yīng)最敏感的指標(biāo)之一。如果每組樣品量足夠大(10或10個以上)，可用下述方法：器官重量計算為體重的百分比。按體重或體重改變分析。如在試驗開始，動物隨機化分組(各組體重均數(shù)差別無顯著性，各組所有的動物體重在總平均體重的2個SD之內(nèi))，利用體重改變分析比較好。對各組資料利用Bartlett方差齊性試驗，檢測方差齊性。根據(jù)方差齊性或不齊，決定進(jìn)一步的統(tǒng)計學(xué)檢驗。如果樣本量較小，可利用Kruskal-Wal?E參數(shù)檢測。B臨床化學(xué)：過去一般用t檢驗或ANOVA,但并非是最適當(dāng)?shù)姆椒?。因為這些生化參數(shù)很少是彼此獨立的。通常，所研究的并不是單獨某一個參數(shù)，而是與靶器官毒作用有關(guān)的一組參數(shù)，如CPK,HBDH和LDH同時增高強烈指示心肌損害。這時我們并不只是注意其中一個參數(shù)的增高，而是全部3個參數(shù)。而血清電解質(zhì)(如鈉、鉀、鈣)常相互影響，一種降低常伴另一種增加。而且資料的性質(zhì)，由于這些參數(shù)的生物學(xué)性質(zhì)或測定的方法，常不服從正態(tài)分布(為偏態(tài)分布)或為非連續(xù)的，如肌昔、鈉、鉀、氯、鈣和血尿素氮。臨床化學(xué)資料適用的統(tǒng)計學(xué)方法：①ANOVA,Bartlett檢驗和/或F檢驗，t-檢驗，適用于：鈣、葡萄糖、BUN、肌苷、膽堿脂酶、總蛋白、白蛋白、HBDH、ALP、CPK、LDH、ALT、AST及血紅蛋白。②Kruskal-Wallis非參數(shù)ANOVA適用于：總膽紅素、GGT。C血液學(xué)：不同物種、品系的實驗動物血液學(xué)檢查的數(shù)據(jù)，所服從的分布也可能是不同的。這些參數(shù)的大部分是相互有關(guān)的，并依賴于所用的測定方法。RBC數(shù)、血小板數(shù)和MCV可用儀器測定，數(shù)據(jù)適用于參數(shù)檢驗。紅細(xì)胞壓積(HCT)是由RBC和MCV得到的計算值，故依賴于此兩個參數(shù)；但如直接測定，也可用參數(shù)檢驗。血紅蛋白是直接測定的并是獨立的連續(xù)數(shù)據(jù)。但如同時存在血紅蛋白的多種形態(tài)(氧血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白等)，則可能不是典型的正態(tài)分布，而呈多模型分布。此時可用wilcoxon檢驗或多重秩和檢驗。WBC總數(shù)服從正態(tài)分布，并適用于參數(shù)檢驗。而WBC的分類或報告為百分比或乘以WBC總數(shù)得“絕對〃分類WBC數(shù)。這些資料，特別是嗜酸性粒細(xì)胞不符合正態(tài)分布，應(yīng)該用非參數(shù)統(tǒng)計。應(yīng)注意,單個參數(shù)的變化很少有生物學(xué)意義,因為這些參數(shù)是相互有關(guān)的,應(yīng)注意發(fā)現(xiàn)并分析預(yù)期的參數(shù)變化譜。D組織病理學(xué)損害發(fā)生率：在亞慢性和慢性毒性試驗，強調(diào)了組織病理學(xué)檢查。統(tǒng)計學(xué)分析是評價處理組動物組織病理學(xué)損害發(fā)生率是否高于對照組動物。除了癌發(fā)生率外，也應(yīng)注重發(fā)現(xiàn)其他病理損害。在處理組和對照組動物病理損害發(fā)生率比較常用卡方檢驗或金卜0律青確檢驗。利用雙側(cè)檢驗還是單側(cè)檢驗取決于研究者的要求。對于多重比較可用Bonferroni法，而且可利用趨勢檢驗來評價劑量-反應(yīng)關(guān)系。E生殖毒性：對生殖毒性的統(tǒng)計學(xué)分析，是以窩或妊娠雌性動物）為實驗單位，而不是幼體。生殖毒性試驗一般可得4個變量：生育力指數(shù)（FI）、受孕指數(shù)（GI）、存活力指數(shù)（VI）和哺育指數(shù)（LI）。對這些變量，如樣本數(shù)為10或10以上可利用Wilcoxon-Mann-whitneyU檢驗或KrusKal-Wallis非參數(shù)ANOVA。如樣本數(shù)小于10，則可用Wilcoxon秩和檢驗（用于2組比較）或Aruskal-wallis非參數(shù)ANOVA（用于3組或3組以上的比較）。F致畸試驗：每組應(yīng)有20只妊娠動物。并且，實驗單位為窩，而不是胎體。如樣本數(shù)為10或10以上，可近似為正態(tài)，利用參數(shù)檢驗（如卡方檢驗、t-檢驗或ANOVA）、來評價結(jié)果。當(dāng)樣本數(shù)小于10，可用非參數(shù)檢驗（Wilcoxon秩和檢驗或Kruskal-wallis非參數(shù)ANOVA）。此外，Wilcoxon-Mann-whitneyU檢驗也廣泛用于致畸試驗。G飼料和染毒柜中受試物濃度分析：當(dāng)受試物摻入飼料進(jìn)行喂飼試驗，或為氣溶膠吸入試驗，應(yīng)定期測定飼料中受試物濃度和染毒柜中受試物氣溶膠的濃度。采樣應(yīng)隨機并有代表性。一般要求飼料或空氣中濃度應(yīng)在預(yù)定濃度的±10%之內(nèi)；顯著增高的峰濃度可能超過代謝或修復(fù)系統(tǒng)能力，出現(xiàn)急性毒作用。如果不了解飼料/空氣中真實的暴露水平，可能錯誤地解釋該受試物的低水平慢性毒性。氣溶膠顆粒直徑分級采樣可能得到分類資料如＞100um,100?25um,25?10um,10?3um等），這種資料應(yīng)該用幾何均數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)差來描述。H致突變性試驗：絕大多數(shù)遺傳毒理學(xué)短期試驗（STT）的觀察值為計數(shù)資料（如突變體數(shù)、畸變數(shù)、SCE數(shù)）或是相對數(shù)（如存活細(xì)胞的突變頻率），因此STT結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)主要是對離散性資料的統(tǒng)計學(xué)推斷。最常用的遺傳毒理學(xué)試驗的統(tǒng)計學(xué)方法：a）Ames試驗的統(tǒng)計學(xué)評價：Ames試驗的結(jié)果每平板回變菌落數(shù)的分布不完全服從泊松分析，有超離差現(xiàn)象；并且，其劑量反應(yīng)曲線呈先上升后下降的傘形。Ames等l975年提出2倍判斷標(biāo)準(zhǔn)，在1983年改進(jìn)的方法中已不再推薦。2倍判斷標(biāo)準(zhǔn)有較大的缺點，此判斷標(biāo)準(zhǔn)不是統(tǒng)計學(xué)判斷，對自發(fā)回變率較高的菌株偏嚴(yán)，而對自發(fā)回變率較低的菌株偏松。已發(fā)展了幾種統(tǒng)計學(xué)方法用于Ames試驗的假設(shè)檢驗和劑量反應(yīng)研究。Kim和Margolin等（1999）利用基于生物學(xué)的機制模型，發(fā)展YSALM程序，用于Ames試驗結(jié)果的判斷。b）遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗：（包括微核試驗、染色體畸變試驗和顯性致死試驗）的統(tǒng)計學(xué)評價：Adler等（1998）提出了3步法。①確定實驗結(jié)果是否可接受。如果同時進(jìn)行的陰性對照的均數(shù)在歷史性對照的均數(shù)±3SD之內(nèi)，則該實驗結(jié)果可以接受。如果不接受，則應(yīng)重新進(jìn)行實驗。②劑量-反應(yīng)分析。利用同時進(jìn)行的陰性對照資料進(jìn)行劑量反應(yīng)趨勢檢驗。有統(tǒng)計學(xué)顯著性的陽性趨勢表明受試物處理的效應(yīng)。③評價各個處理組反應(yīng)，然后將各個處理組的均數(shù)分別與歷史性陰性對照比較，如各個處理組均未顯示差別顯著性，但趨勢檢驗有顯著性意義，此實驗結(jié)果的解釋需要生物學(xué)判斷。如果趨勢無顯著性，但經(jīng)多重比較校正后僅一個處理組與歷史性陰性對照比較差別有顯著性（SimesRJ.Biometricsl986；73：751-754）,則此試驗結(jié)果的解釋也需要生物學(xué)判斷。這時，可認(rèn)為該實驗的結(jié)果為可疑。同時陰性對照與歷史性對照 -重新試驗（均數(shù)±3SD）比較 在范圍之外I在范圍之內(nèi)用同時陰性對照進(jìn)行趨勢檢驗有顯著性I I無顯著性各處理組與歷史、 /各處理組與歷史性陰性對照比較性陰性對照比較有顯著性I 無顯著性I有顯著性 I有顯著性陽性 可疑 陰性圖5-2遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗統(tǒng)計學(xué)評價的程序。I行為毒理學(xué)：行為毒理學(xué)試驗一般得到4種類型的資料：①觀察的記分值，來自開闊場試驗等；②反應(yīng)率，來自舔液，總活動或壓桿；③錯誤率，來自學(xué)習(xí)-記憶試驗④到達(dá)終點的時間。對這些數(shù)據(jù)常用的和推薦的統(tǒng)計學(xué)方法見表1-4。行為發(fā)育毒性和生殖毒性研究的統(tǒng)計學(xué)方法也見表1-4,在斷乳前應(yīng)以窩為實驗單位進(jìn)行統(tǒng)計。表1-4行為毒理學(xué)的統(tǒng)計學(xué)方法（Gad等，1994）觀察類型常用的方法推薦的方法觀察記分值t檢驗或單例ANOVAKruskal-Wallis非參數(shù)ANOVA或Wilcoxon秩和檢驗反應(yīng)率t檢驗或單側(cè)ANOVAKruskal—wallisANOVA或一側(cè)ANOVA錯誤率ANOVA檢驗，再進(jìn)行Posthoc檢驗Fisher精確檢驗或RXC卡方，Mann—WhitneyU檢驗到達(dá)終點時間t檢驗或一側(cè)ANOVAANOVA檢驗再進(jìn)行Posthoc檢驗或Kruskal-WallisANOVAA行為發(fā)育或生殖試驗ANOVA檢驗，再分別進(jìn)行檢驗Fisher精確檢驗或Kruskal-Wallis非參數(shù)AN0VA或Mann-WhitueyU檢驗2、統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義在評價毒理學(xué)試驗結(jié)果時，要綜合評價實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義。一般來說，具有統(tǒng)計學(xué)意義是具有生物學(xué)意義的必要條件之一。正確地利用統(tǒng)計學(xué)假設(shè)檢驗的結(jié)果有助于確定實驗結(jié)果的生物學(xué)關(guān)聯(lián)。在判斷生物學(xué)意義即生物學(xué)重要性）時，可考慮以下步驟。（1）縱向比較：此參數(shù)的改變有無劑量-反應(yīng)關(guān)系?；瘜W(xué)物毒作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系是毒理學(xué)研究的基本假設(shè)。當(dāng)某參數(shù)的改變存在陽性劑量-反應(yīng)關(guān)系，就可認(rèn)為此參數(shù)的改變與受試物染毒有關(guān)，具有生物學(xué)意義。⑵橫向比較：此參數(shù)的改變是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變。例如，生化參數(shù)很少是彼此獨立的，單個劑量組的一個參數(shù)有統(tǒng)計學(xué)顯著性的改變一般不認(rèn)為有生物學(xué)意義，除非此改變?yōu)槠渌麉?shù)改變所支持。如沒有骨髓或脾組織學(xué)改變或沒有高鐵血紅蛋白生成，則單有紅細(xì)胞計數(shù)的改變是沒有生物學(xué)意義的。同樣，在免疫毒理學(xué)中，單有淋巴細(xì)胞計數(shù)的改變不伴有淋巴結(jié)組織學(xué)改變也可能是沒有生物學(xué)意義的。（3）與歷史性對照比較：由于目前尚無公認(rèn)的實驗動物參考'正常〃值，應(yīng)由本實驗室利用相同品系的實驗動物和相同的溶劑，進(jìn)行至少10次獨立實驗的陰性（溶劑）對照的資料構(gòu)成，以其均值±1.96X標(biāo)準(zhǔn)誤作為參考值的范圍。同時進(jìn)行的陰性對照應(yīng)在歷史性對照的均數(shù)±3SD范圍之內(nèi)，否則應(yīng)重新試驗。另有認(rèn)為，凡某種觀察值與對照組比較，差別具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＜，并符合下列情況之一者，即可認(rèn)為已偏離正常參考值范圍，屬于有害作用。①其數(shù)值不在正常參考值范圍之內(nèi)；②其數(shù)值在正常參考值范圍之內(nèi)，但在停止接觸后，此種差異仍持續(xù)一段時間；③其數(shù)值在正常參考值范圍之內(nèi)，但如機體處于功能或生化應(yīng)激狀態(tài)下，此種差異更加明顯。應(yīng)該指出，后兩種情況需要附加的試驗設(shè)計。另外，還有一些其他的考慮。如處理組同時與對照組兩組均數(shù)之差值應(yīng)超過檢測誤差的兩倍以上。某些血液生化指標(biāo)（如AST、ALT等）的測定值升高才有生物學(xué)意義。當(dāng)處理組數(shù)據(jù)與陰性對照組比較差別有顯著性，并且經(jīng)分析認(rèn)為是與處理有關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步判斷其為有害效應(yīng)還是非有害效應(yīng)。決定一種效應(yīng)是否為有害作用需要專家的判斷。不同指標(biāo)或參數(shù)的生物學(xué)意義和重要性是不同的。在分析和綜合評價實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義時，可能遇到四種情況，見表1-5。在此表中，第I和第W種情況最為常見，第I種情況是無統(tǒng)計學(xué)意義也無生物學(xué)意義，第W種情況是有統(tǒng)計學(xué)意義也有生物學(xué)意義。但是有時在實驗結(jié)果中會出現(xiàn)第n和第m種情況。表1-5毒理學(xué)試驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義生物學(xué)意義無統(tǒng)計學(xué)意義有無Im有nW第m種情況是有統(tǒng)計學(xué)意義但無生物學(xué)意義，例如在某個亞慢性毒性試驗中，中劑量組動物血液白細(xì)胞計數(shù)低于陰性對照組，差別有顯著性（p<,而高劑量組和低劑量組動物血白細(xì)胞計數(shù)與陰性對照組比較差別無顯著性（p>。由于在此實驗結(jié)果中未出現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，因此中劑量組血液白細(xì)胞計數(shù)降低可能是由于偶然因素造成的，沒有生物學(xué)意義。但是，如果僅在高劑量組動物血液白細(xì)胞計數(shù)降低，與陰性對照組比較差別有顯著性（p<）時，必須仔細(xì)地核實高劑量組的資料。如果資料無任何疑問，可認(rèn)為此變化可能具有生物學(xué)意義。最好是重新進(jìn)行一個亞慢性毒性試驗，并加大受試物的劑量，如果能夠觀察到劑量-反應(yīng)關(guān)系，則說明此劑量組血白細(xì)胞計數(shù)降低是有生物學(xué)意義的；如果加大受試物劑量沒有觀察到劑量-反應(yīng)關(guān)系，才可以說此劑量組血白細(xì)胞計數(shù)降低沒有生物學(xué)意義。因此，在判斷實驗結(jié)果的生物學(xué)意義時，有無劑量-反應(yīng)關(guān)系是關(guān)鍵。有統(tǒng)計學(xué)意義但無生物學(xué)意義的情況，更常見的是因為實驗設(shè)計和實施不良所致。第n種情況是具有生物學(xué)意義但無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是因為該事件的發(fā)生是極端罕見的，例如在哺乳動物致癌試驗中，在染毒組中出現(xiàn)對照組中沒有的腫瘤類型，盡管從統(tǒng)計學(xué)上此種腫瘤的發(fā)生率很低，與對照組比較差別無顯著性（p>,但還應(yīng)該認(rèn)為是有生物學(xué)意義的。利用一種以上的實驗動物，當(dāng)某種效應(yīng)在一個物種出現(xiàn)而在另一物種不出現(xiàn)，或一個物種遠(yuǎn)比另一物種敏感時，則使結(jié)果的解釋復(fù)雜化，難以確定以哪個物種的實驗結(jié)果外推到人最為合適。除非有足夠的資料（通常是比較毒動學(xué)或毒效學(xué)資料）可以表明最合適的物種，一般是以最敏感的物種來確定NOAEL和安全限值。以上我們討論了毒理學(xué)動物實驗的基礎(chǔ)，介紹了對外源化學(xué)物進(jìn)行毒性評價的實驗設(shè)計、實施、結(jié)果分析等各個環(huán)節(jié)。實驗的質(zhì)量控制是保證實驗數(shù)據(jù)具有科學(xué)性、準(zhǔn)確性和公正性的先決條件。沒有質(zhì)量保證，實驗數(shù)據(jù)的可靠性是無法肯定的。我們在安全性毒理學(xué)試驗設(shè)計、實施、總結(jié)報告的各個環(huán)節(jié)上，應(yīng)該自覺、主動地遵循GLP原則，逐步從人員的組成和職責(zé)、設(shè)施、設(shè)備、質(zhì)量保證部門QAU）、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）、受試品與對照品、實施方案、實驗記錄和總結(jié)報告等各個方面落實GLP。實驗二實驗動物的一般操作技術(shù)一、目的和意義毒理學(xué)研究需要用實驗動物來進(jìn)行各種實驗，通過對動物的實驗觀察和分析來研究毒作用，獲得毒物的毒性、劑量一反應(yīng)關(guān)系、毒作用機制等方面的資料，因此動物實驗是毒理學(xué)研究中重要的手段之一。通過本次實習(xí)學(xué)習(xí)毒理學(xué)實驗中有關(guān)動物實驗的基本操作技術(shù)，掌握實驗動物的選擇、動物抓取、染毒方法和生物材料的采集等技術(shù)。二、內(nèi)容（一）健康動物的選擇無論選擇哪種種屬品系的動物進(jìn)行實驗，均要求選擇健康的實驗動物。健康動物檢查時要求達(dá)到：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動迅速，反應(yīng)靈活，食欲及營養(yǎng)狀況良好。選擇時重點檢查以下項目：.眼睛明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無分泌物。.耳耳道五分泌物溢出，耳殼無膿瘡。.鼻無噴嚏，無漿性粘液分泌物。.皮膚無創(chuàng)傷、無膿瘡、疥癬、濕疹。.頸部要求頸項端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不應(yīng)選作實驗動物。6,消化道無嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門附近被毛潔凈。.神經(jīng)系統(tǒng)無震顫、麻痹。若動物（大鼠、小鼠）出現(xiàn)圓圈動作或提尾倒置呈圓圈擺動，應(yīng)放棄該動物。.四肢及尾四肢、趾及尾無紅腫及潰瘍。（二）實驗動物的性別鑒定動物性別不同對毒物的敏感性也不同，這可能與性激素、肝微粒體羥基化反應(yīng)有關(guān)，也隨受試物而異。因此，要根據(jù)實驗要求選擇性別，一般實驗如對性別無特殊要求者，宜選用雌雄動物各半。.大鼠、小鼠主要依肛門與生殖器孔間的距離加以區(qū)分。間距大者為雄性，小者為雌性。雌性生殖器與肛門之間有一無毛小溝，距離較近。雄性可見明顯的陰囊，生殖器突起較雌鼠大肛門和生殖器之間長毛。另外成年雄性臥位可見到睪丸雌性在腹部可見乳頭。圖2-1雌雄動物肛門與外生殖器間距離

.豚鼠用一只手抓住豚鼠頸部，另一只手扒開靠生殖器孔的皮膚，雄性動物在圓孔中露出性器官的突起，雌性動物則顯出三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個乳頭。.家兔將家兔頭輕輕夾在實驗者左腋窩下，左手按住腰背部，右手拉開尾巴并將尾巴夾在中指和無名指中間，然后用拇指和食指稍稍把生殖器附近的皮膚扒開。雄兔即可見到一圓孔中露出圓錐形稍向下彎曲的陰莖（但幼年雄兔看不到明顯的陰莖，只能看到圓孔中有凸起物，即是陰莖）。雌兔此處則為一條朝向尾巴的長縫，呈橢圓形的間隙，間隙越向下越窄，此即為陰道開口處。雄性圖2-2 兔雌雄生殖器外型特征與差異（三）實驗動物的抓取方法正確地抓取固定動物，是為了在不損害動物健康、不影響觀察指標(biāo)、并防止被動物咬傷的前提下，確保實驗順利進(jìn)行。.小鼠的抓取方法首先用右手從籠盒內(nèi)抓取鼠尾提起，注意不可抓尾尖（見圖A）,放在鼠籠蓋或?qū)嶒炁_上向后拉（見圖B）,在其向前爬行時，迅速用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚（見圖C）,將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，以無名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（見圖D）。

D圖2-3小鼠的抓取.大鼠的抓取方法大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中，這樣右手可進(jìn)行各種實驗操作。A B圖2-4大鼠的抓取

3.豚鼠的抓取方法豚鼠膽小易驚，在抓取時要穩(wěn)、準(zhǔn)、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，

抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部（見圖A）,另一只手托住臀部即可（見圖B）。A B圖2-5豚鼠的抓取4.兔的抓取方法用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取雙耳或抓提腹部。圖2-6兔的抓?。ㄋ模嶒瀯游锓Q重、編號、標(biāo)記方法.稱重大、小鼠秤的感應(yīng)量需在0.1g以下。根據(jù)實驗的不同要求，選擇一定數(shù)量的大、小鼠，體重要求在同一組內(nèi)、同性別動物體重差異應(yīng)小于平均體重的10%,不同組間同性別動物體重均值差異應(yīng)小于5%。.編號動物編號方法有多種。大、小鼠常用方法如下：（1）染色法：染色法是用化學(xué)劑在動物身體明顯部位如皮毛、四肢等處進(jìn)行涂染，或用不同顏色等來區(qū)別各組動物，是實驗室最常用、最容易掌握的方法。常用的標(biāo)記液有苦味酸酒精飽和溶液（黃色）。標(biāo)記時，用標(biāo)記筆 取上述溶液，在動物體表不同部位涂上斑點，以示不同號碼。一般把涂在右前肢上的記為1號，按順時針方向，依次右后肢為2號，左后肢為3號，左前肢為4號，頭部為5號（見圖2-7A）,6-10則由以上5個基本數(shù)復(fù)合而成，比如6號則是在頭部和右前肢標(biāo)記各一（見圖2-7B）,7號為在頭部和右后肢體標(biāo)記一，以此類推。在動物的背部劃一長條為10號。10號以上均由上述復(fù)合方法進(jìn)行編號。例如：16號是在頭部、右前肢、背部均有標(biāo)記（見圖2-7C）。

圖2-7A 圖2-7B 圖2-7C⑵剪耳法：在耳朵不同部位剪一小孔代表某個號碼。常以右耳代表個位，左耳代表十位?；蚺c染色法配合使用，右耳剪孔代表十位。圖2-8小動物剪耳法標(biāo)記號碼⑶烙印法：是用刺數(shù)鉗在動物耳上刺上號碼，然后用棉簽蘸著溶在酒精中的黑墨在刺號上加以涂抹，烙印前最好對烙印部位預(yù)先用酒精消毒。⑷號牌法：用金屬的牌號固定于實驗動物的耳上，大動物可系于頸上。（五）實驗動物的分組方法為了得到客觀的劑量一反應(yīng)關(guān)系，應(yīng)將一群動物按統(tǒng)計學(xué)原則隨機分配到各個實驗組中?？砂措S數(shù)字表方法進(jìn)行隨機分組（見隨機數(shù)字表方法分組說明）。但小動物的年齡和體重呈正相關(guān)，而年齡又與毒物代謝動力學(xué)密切相關(guān)。為了減少實驗各組動物間的體重差異，在實際工作中常采用體重均衡法（簡化分層隨機法）進(jìn)行分組，即將同一性別的動物按體重大小順序排列，分組時由體重小的到大的，依次隨機分配到各組。一種性別的動物分完以后，再分配另一種性別的動物。各組雌雄性動物的數(shù)目應(yīng)盡可能相等。體重均衡法分配方法如下：第一步將動物按體重分組以急性毒性實驗時使用小鼠為例，一般按照18?g,19?g,20?g,21?g,22?g,23?g,24?g分為7組，所有動物稱重后放入相應(yīng)的體重組中。

第二步將同一體重段的動物均勻分配至各試驗組中從最低體重組中隨意取出一只動物放入實驗組第一組，第二只動物放入第二組，以此類推，直到該組動物用完。再從下一體重組中隨意取出動物，依次放入各實驗組直至實驗各組均得到一只動物。如此反復(fù)循環(huán)操作，將所有動物分完為止，結(jié)果會使體重相近的動物被均勻分布到各實驗組中。隨機數(shù)字表方法分組說明：例如：設(shè)將30只雄性動物平均分成A、B、C、D、E、F六組，每組5只動物。將巳編號的動物以號碼按隨機數(shù)字表進(jìn)行分配。如選隨機數(shù)字表第二行，從第一個數(shù)字開始，順次抄下30個數(shù)字（可依橫行、豎行或斜行抄錄）。將每個數(shù)字一律除以6（組數(shù)），根據(jù)余數(shù)1、2、3、4、5、0（整除者）分別將動物分配到A、B、C、D、E、F組，結(jié)果見表1（數(shù)字源見第二行駛隨機數(shù)字表）0347437386977424解6215,766227660347437386977424解6215,766227661?568599265559563564369647366142811457漪56502671079696SS27313854824G469663 62■12三3323732329079785305037295153162430990S32GE86045073G075113553858595712101421OG1844眈53CO11U1095246179S9738B9754U1088264931762383Oil3030表2-1 動物隨機分組表動物號1234 56 78 9101112 131415隨機數(shù)字除6余數(shù)2分組B971A742B240F67 6212AB428103FC145723BC20422B53 3205FE372B321A動物號16171819 2021222324252627 282930隨機數(shù)字除6余數(shù)分組F273C71A3607 5113FA245103CF798915CA731E164A76 6242DD273B660C按上法分組后，A組有動物7只，B組7只，C組6只，D組與E組各2只，F(xiàn)組6只。為了使每組動物數(shù)均為5只，需要根據(jù)隨機分配的原則再選出2只A組和1只C組動物給D組。B組選出2只，F(xiàn)組選出1只給E組。具體方法如下：繼續(xù)抄下隨機數(shù)字分別除以A、B、C、F組的動物數(shù)，既56/7（7為A組動物數(shù)）整除，余數(shù)為0，將A組第7只動物（25號）調(diào)配給D組；下一個：50/6（6為A組動物數(shù)）余2，將A組第2只動物（4號）調(diào)配給D組；接下來26/6（6為C組動物數(shù)）余2，將C組第2只動物（9號）給D組。余類推，最后調(diào)整分組成表2所示。雌性動物也按上法分組，然后將雌、雄動物合組進(jìn)行試驗。表2-230只動物隨機分組組別 鼠 號 組別 鼠 號A 1，14，17，19，23 D 4， 9，25，26，27B 5，8， 10，13，15 E 2， 6，12，24，28C 7，16，20，22，29 F 3，11，18，21，30附表：隨機數(shù)字表

IK22779J398dIK22779J398d421753316301637S5933El123429576。863244181?07924&2G623E9775234240647452362S199E378594耨12702917n1356621837359949572277160315047231工6933243€834301370745725B57627423786530039682961?99498942.4IC90S2S659112794750635241016203：J23IS26333196jS91176667406714149031451168G551IS00204678739064195897790526937060079710S323G8718&85852699616353J46552687517527758719026592119412352559960加三0816991253gOS9034535?743785220439430979137748SS75?01814909G2370DO4954135d8257245506881695550719736d5607B!309472796544i171￡580984IS074499829777778i509226JJ97833950OS初403320382696S350S77588429545”3327143409502789871955743077405929976g6048559065736637322030Eg4g6910?283626411120609197466333251263&423897015096443349136405719586757388OS903396027519975140140215061593202235321513099842996454876647545837738070875936224171H615072235223331231044969963199F368689d5828-tt$693gO330。9173Bl53947973S22E212295754249380。030690173793237877047447679￡IQ5Q7175524207U3819174609627983861962831146322407453214030056763142340796￡i?1389510374971?259347166-j361600代59346&492015370049U2.278 2671913867549657冷9朧107784570329537591933。67190071740294373$0279784504乳877568Bl41348682539111056509685?274114死076062935504Q33331090190107S069203515977617162991573320811124￡10506742267863幀&5工24194962f]&693Q2X339104748458&3581330376453759030909779319823352468628Q5Q32724葭3932R2224978383日373G20鄴432176335Q:%12867358C7Id51flO13429052847727067650031020148588力弓M疆940772足口22025353544206&7931776371304703324。甘5d044318667912720734155285GB604404334G09521358IS24769G4692d245IQ45650426弘252G57276。472129居7670903086169253561$400174乳6200?必。85768320379022981222085933S243903954164g3S4078788962595678068s06512916934495926316321755857413082701504d952736990702133607134443893024卻1243筑9035引:「：749-1800401州31544631728944056。02480770379437306932H4 26 34 91 6483 92 12 06 7644 39 52 38 7999 66 0^ 75 "08 02 73 43 2855 23 64 05 0310 93 72 胎 719385791075866042。4羽358529如3907742119309777例U809477U切90397772NEIA3863&&11808B0797於571554559552976Q49049111Q4966724404873519202023703313845943038027550959；4851840B二二27E52639M571600116607527495M4936判445947959313300267741733529105707458057709三1295G2429，?洎944457169115293939029S743DE3259932702397171149171?9910723482€35465601507打664953911328473EK039948816046167879089007633（六）實驗動物被毛去除方法方法有三種：剪毛、拔毛和脫毛。1.剪毛固定動物后，用粗剪刀剪去所需部位的被毛。應(yīng)注意以下幾點:①把剪刀貼緊皮膚剪，不可用手提起被毛，以免剪破皮膚；②依次剪毛，不要亂剪；③剪下來的被毛集中在一個容器內(nèi)，勿遺留在手術(shù)野和操作臺周圍。.拔毛多用于兔耳緣靜脈注射或取血時，以及給大、小鼠作尾靜脈注射時，需用拇指、食指將局部被毛拔去，以利操作。.脫毛脫毛系指用化學(xué)藥品脫去動物的被毛，適用于無菌手術(shù)野的準(zhǔn)備以及觀察動物局部皮膚血液循環(huán)和病理變化。常用硫化鋇或依據(jù)脫毛劑配方配制脫毛劑。（七）實驗動物染毒途徑和方法毒理學(xué)試驗中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同途徑的吸收速率，一般是：靜脈注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射〉皮下注射〉經(jīng)口〉皮內(nèi)注射＞其他途徑（如經(jīng)皮等）。毒理學(xué)則主要采用經(jīng)口（胃腸道）染毒常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。⑴灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。一般灌胃深度從口至劍突下，最好是利用等容量灌胃法，即受試物配制成不同濃度，實驗動物單位體重的灌胃容量相同。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小時（因小鼠消化吸收和代謝速度較快），均不停飲水。灌胃后2?4小時提供飼料。經(jīng)口多次染毒，一般不禁食，但應(yīng)每日定時染毒。灌胃法優(yōu)點是劑量準(zhǔn)確，缺點是工作量大，并有傷及食道或誤入氣管的可能。灌胃針與灌胃方法：圖2-9灌胃針（規(guī)格：直徑XL50mm、XL70mm）圖2-10小鼠灌胃法

圖2-11大鼠灌胃法⑵吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動物咽下，此法劑量準(zhǔn)確，適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。⑶喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。飼料中摻入受試物不應(yīng)超過5%,以免造成飼料營養(yǎng)成分改變而影響實驗動物的生長發(fā)育。喂飼法符合人類接觸受試物的實際情況，但缺點多，如適□性差的受試物，實驗動物拒食；易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。而且，實驗動物應(yīng)單籠喂飼，以食物消耗量計算其實際染毒劑量。（八）實驗動物生物材料采集和制備1.動物常用采血方法（1）大、小鼠鼠尾采血方法：適用于需血量少的實驗。方法：將動物固定后，把鼠尾浸入5?50℃溫水中使尾靜脈充血，擦干皮膚后，再用酒精棉球擦拭消毒。剪去尾尖約0.2?0.3cm）,拭去第一滴血，用血色素吸管（根據(jù)需要事先在吸管內(nèi)加入與不加抗凝劑）吸取一定量尾血，然后用于棉球壓迫止血。也可以不剪尾，以lml注射器連上7?8號針頭直接刺破尾靜脈進(jìn)行定量采血。⑵眼眶靜脈叢采血法：操作者以左手拇指、食指緊緊握住大鼠或小鼠頸部壓迫頸部兩側(cè)使眶后靜脈叢充血（注意用力要恰當(dāng)，以防止動物窒息死亡），右手持玻璃毛細(xì)管從一側(cè)眼內(nèi)眥部以45角刺入，捻轉(zhuǎn)前進(jìn)。如無阻力繼續(xù)刺人，有阻力就抽出玻璃毛細(xì)管調(diào)整方向后再刺入，直至出血為止。右手持容器收集血液后，拔出毛細(xì)管，用干棉球壓迫止血。圖2-12小鼠眶靜脈叢（竇）采血⑶腹主動脈或股動（靜）脈采血法：為一次性采血方法。大、小鼠麻醉后，仰臥位固定動物，剪開腹腔，剝離暴露腹主動脈或暴露股動（靜）脈，用注射器刺人采血.⑷斷頭采血法：該法可用于大、小鼠。操作者左手握住動物，右手持剪刀，快速剪斷頭頸部，倒立動物將血液滴入容器。注意防止剪斷的毛發(fā)掉入接血容器中。也可用大鼠斷頭器斷頭后，倒立動物接血。⑸家兔耳緣靜脈采血法：家兔在兔盒中固定，拔掉一側(cè)耳緣部細(xì)毛，輕輕以手指彈耳，使耳緣靜脈充血，酒精消毒。左手壓迫耳根，右手持針刺破靜脈收集血液；或直接用注射器進(jìn)針，耳緣靜脈采血。⑹心臟采血法：將兔或大、小鼠以仰臥位固定，家兔需在左側(cè)胸3一4肋部位剪毛，常規(guī)消毒。于第3?4肋間近胸骨左緣處，手觸心搏最強部位進(jìn)針，采血。采血畢迅速拔針，用酒精棉球壓迫止血。大、小鼠則在手觸心搏最明顯處進(jìn)針。實驗動物每次（日）采血量不可過多，最大安全采血量見表2-1。 表2-3實驗動物安全采血量 動物品種 最大安全采血量（1ml） 最小致死采血量（ml）小鼠大鼠豚鼠家兔 2.動物尿液的收集收集大動物與小動物的尿液，一般使用不同類型的代謝籠。代謝籠主要由備有動物飲水和裝飼料的籠體、糞尿分離器和收集尿液容器組成。一般籠體為金屬與鐵絲制成，如實驗要求防止金屬污染時，則代謝籠應(yīng)用玻璃或有機玻璃制作。兔、狗等大動物也可用導(dǎo)尿法收集尿液。為了使收集的實驗動物尿液滿足試驗需要，可在收尿前給動物一定量的水，如大鼠可先行灌胃1?5ml水或腹腔注射生理鹽水.（九）實驗動物的處死方法：.頸椎脫臼法左手按住鼠頭，右手抓住鼠尾猛力向后拉，使動物頸椎拉斷脫節(jié)而立即死亡。此法多用于處死小鼠。.斷頭法操作者用右手按住大鼠或小鼠頭部，左手握住背部，露出頸部，助手用大剪刀或斷頭器剪斷頸部使之死亡。也可使用斷頭器。.擊打法右手抓住鼠尾，提起，用力摔打其頭部；鼠痙攣后立即死亡。也可用小木錘或器具猛力擊打動物頭部，使其立即死亡，常用于處死家兔或大鼠。.麻醉致死法在密閉容器中預(yù)先放入麻醉劑（氯仿或乙醚），然后將動物放入，密封蓋好，使動物吸人過量麻醉劑致死。.麻醉后急性放血法該法多用于處死大鼠。先腹腔注射麻醉動物后，固定動物于仰臥位，左手持鑷子提起大腿內(nèi)側(cè)皮膚，右手用剪刀作一切口并向腹股溝方向剪開皮膚，皮膚切口長約3—4cm。用鑷子分離筋膜，于腹股溝中點大腿內(nèi)側(cè)深部，暴露股動脈和靜脈，用剪子剪斷股動脈即有大量血液流出，動物迅速死亡。.空氣栓塞法用注射器向動物靜脈內(nèi)迅速注入一定量的空氣，使之形成氣栓栓塞血管，引起循環(huán)障礙致死。該法適用于大動物，如兔、狗、猴等。使用時注意需注入足夠量的空氣。.化學(xué)藥物致死法此法適用于較大動物如兔或狗等。方法是給動物靜脈注射化學(xué)藥物而致死。常用10%KCI或10%甲醛溶液進(jìn)行靜脈注射。.開放性氣胸法將動物開胸，造成開放性氣胸，此耐胸膜腔的壓力與大氣壓力相等，肺臟因受大氣壓縮發(fā)生萎縮、縱隔擺動使動物窒息而死。實驗三滅多威經(jīng)口急性毒性試驗一、目的化學(xué)毒物經(jīng)□急性毒性試驗是研究化學(xué)物毒性效應(yīng)的基本試驗。本次實習(xí)的目的是學(xué)習(xí)急性毒性試驗的實驗設(shè)計原則，學(xué)會動物分組方法，掌握經(jīng)口灌胃技術(shù)和中毒癥狀的觀察。二、原理選擇健康的實驗動物，根據(jù)體重按隨機分組的方法，依據(jù)ld50計算的設(shè)計原則將動物分成數(shù)個染毒組。一次或24h內(nèi)多次給予受試物后，了解動物所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，觀察受試物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系，求出半數(shù)致死劑量（ld50）,并根據(jù)ld50值將受試物進(jìn)行急性毒性分級。三、內(nèi)容.健康小鼠的選擇，性別的辨認(rèn)。.稱重、編號和隨機分組方法。.受試化學(xué)物溶液的配制。.小鼠經(jīng)口灌胃操作技術(shù)。.毒性體征的觀察、LD50計算和毒性分級。四、材料和試劑.實驗動物健康成年昆明小鼠60只，體重22g-24g,雌雄各半。.器材動物稱（感應(yīng)量1000g、灌胃針（小鼠用）、注射器（1ml）、刻度吸管、、、、10.0ml）、容量瓶（10ml）、燒杯（10、250m1）、滴管、編號筆、小瓷盤、動物籠。.試劑受試物：滅多威（工業(yè)品，含量40%）,苦味酸酒精飽和液。五、操作步驟（一）健康小鼠的選擇（見實習(xí)二），本次實驗提供健康小鼠。（二）性別辨認(rèn)（見實習(xí)二）（三）小鼠稱重、編號與分組：.稱重稱量小鼠體重的秤，其感應(yīng)量需在0.1g以下，并經(jīng)過校正。稱量時注意輕抓輕放，避免激惹小鼠，等小鼠安靜后記錄體重讀數(shù)，以g表示。.編號染色法編號（見實習(xí)二）.分組體重均衡法分組（見實習(xí)二）（四）劑量設(shè)計本實驗設(shè)6個劑量組，設(shè)計方案如下：TOC\o"1-5"\h\z組 另IJ 1 2 3 4 5 6劑量（mg/kg） 100灌胃液濃度（mg/ml） 5（五）受試物的配制實驗給藥的劑型，可視毒物的溶解性能采用水溶液、混懸液、油劑或乳劑。本次實驗用水溶液。非吸入染毒實驗，各劑量組多按單位體重給予等容量藥液的方法給藥，故需先確定單位體重給藥容量（小鼠灌胃通常用?0.2m1/10g體重），然后按實驗設(shè)計的最大劑組藥液濃度計算配制所需的毒物量,配成第I號藥液，再按設(shè)計的組距，逐組稀釋，配制出所需組數(shù)的藥液。1.滅多威灌胃液的配制，按照上述設(shè)計的6個劑量組：最大劑量組為100mg/kg體重（1mg/10g）設(shè)給藥容量為0.2m1/10g體重則藥液濃度應(yīng)為1mg/0.2m1（5mg/ml）。配制100m1藥液需受試物的量為：5mg/m1x100m1=500mg準(zhǔn)確稱取滅多威500mg，用少量蒸餾水溶解后，移入100m1容量瓶，然后加蒸餾水稀釋至刻度，此溶液濃度為5mg/ml（實驗教師已配好）。余下各組需學(xué)生自行配制。（六）灌胃操作小鼠灌胃法（見實習(xí)二實驗動物的染毒途徑和方法）：采用專用小鼠灌胃針，安裝在1ml的注射器上，吸取所需的滅多威溶液，左手抓住小鼠的雙耳后、頸部的皮膚，用無名指、小手指和大魚際肌將其尾根部壓緊，將小鼠固定成垂直體位，腹部面向操作者。注意使動物的上消化道固定成一直線。右手持注射器，將針頭由動物口腔側(cè)插入，避開牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動探索，一旦感覺阻力消失，即可深入至胃部。如遇動物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，千萬不能強行插入，以免穿破食管，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動物立即死亡。注意要點：①小鼠一定要固定好。②頭部和頸部保持平展。③進(jìn)針方向正確。④一定要沿著口角進(jìn)針，再順著食管方向插入胃內(nèi)；⑤決不可進(jìn)針不順就硬向里插。一般進(jìn)針深度小鼠?4cm,大鼠或豚鼠4?6cm。為了驗明是否已正確地插入胃部，可輕輕回抽注射器，如無氣泡抽出，表明已插入胃中；如有大量氣泡，則提示誤插氣管，應(yīng)抽出重插。隨后將受試物溶液注入。灌胃容量小鼠通常為?1ml,大鼠1?4ml,豚鼠1?5ml。（七）中毒體征和動物死亡情況觀察和ld50計算.中毒癥狀染毒后注意觀察毒性體征和死亡情況。高劑量組動物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應(yīng)即刻密切觀察。觀察和記錄中毒體征及出現(xiàn)的時間、死亡數(shù)量和時間及死亡前的特征。根據(jù)觀察情況分析中毒特點和毒作用靶器官。按照實驗結(jié)果，填寫急性毒性實驗記錄表。染毒時間2小時。表3-1急性毒性實驗原始記錄受試物名稱： 動物種屬品系： 性別：動物來源及合格證號： 染毒途徑： 劑量組別:室溫： 日期：動物體重灌胃量體征及出現(xiàn)時間編號(g)(ml)震抽流針尖樣管狀側(cè)腹式死顫搐涎瞳孔尾 臥呼吸亡12345實驗操作者： 實驗記錄者:.LD50計算采用改進(jìn)寇氏法求出LD50及95%的可信限范圍，計算方法見附錄。六、結(jié)果評定根據(jù)小鼠中毒體征、死亡時間和特征、LD50,參照農(nóng)藥急性毒性分級（見表3-2經(jīng)口LD50）進(jìn)行評定，判斷該受試物的毒性大小及毒性特征。表3-2農(nóng)藥的急性毒性分級［經(jīng)口LD50（mg/kg）］毒性分級 劇毒 高毒 中等毒 低毒mg/kg 〈5 5? 50?500 〉500（引自:張橋主編的衛(wèi)生毒理基礎(chǔ)衛(wèi)生毒理學(xué)實驗方法.北京：人民衛(wèi)生出版社.2001,215）七、注意事項.注意自我保護(hù)。.灌胃前，各組受試物溶液均應(yīng)充分混勻。.灌胃時，推進(jìn)速度不能太快或太慢，以免動物將藥液嘔出或因掙扎而傷害上消化道的粘膜。.應(yīng)選用針尖圓純的灌胃針頭進(jìn)行灌胃。.中毒死亡及脫臼處死的小鼠，裝進(jìn)塑料袋（注意不要夾帶任何雜物放進(jìn)塑料袋），送到801室集中放到專用紡織袋置于冰柜冷凍貯存待銷毀。.按規(guī)定方法銷毀剩余受試物。八、實驗報告實驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容：.實驗動物的種屬、品系、性別及來源。實驗前動物禁食和健康狀況。.實驗動物體重和隨機分組情況。.受試物的名稱、來源、純度、性狀等情況。.受試物的配制和溶媒。.詳細(xì)描述實驗觀察的中毒表現(xiàn)和死亡情況等（表1）。.LD50的計算方法和結(jié)果。.受試物的毒性分級、分級依據(jù)和結(jié)果評價。九、附錄LD50（LC50）計算方法:改進(jìn)寇氏法改進(jìn)寇氏法是利用對數(shù)與死亡率呈S型曲線而設(shè)計的方法，又稱Karber法或平均致死量法。該法計算簡便，準(zhǔn)確率高，是較為常用的方法。本法要求每個染毒劑量組動物數(shù)要相同，各劑量組組距呈等比級數(shù)，死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率呈＜20%,最高劑量組死亡率＞80%。計算公式如下：m=Xk-i（Xp一0.5）Sm=i儼pq式中：m:lgLD5oi:相鄰兩劑量組之間之對數(shù)劑量差值；Xk：最大劑量的對數(shù)值；q:存活率(q=1-p)；Ep：各劑量組死亡率總和；n:每組動物數(shù)。例如：小鼠經(jīng)□給予某化學(xué)物質(zhì)的劑量和死亡數(shù)資料見下表2。表3-3某化學(xué)物質(zhì)小鼠經(jīng)口染毒死亡情況組另IJ _劑量動物數(shù)(n)死亡數(shù)(只)死亡率(P)存活率(q)p.qMg/kg對數(shù)11002102310541075109i=2P=按式計算得：lgLD50==Sm=,0.160.250.210.09++ +10 101010=lgLD50及其95%可信限為土X=±所以lgLD50及95%可信區(qū)間范圍為kg(?kg)。實驗四苯經(jīng)呼吸道急性毒性試驗一.目的經(jīng)呼吸道急性毒性試驗是衛(wèi)生毒理學(xué)的重要基本實驗技術(shù)之一。外源性化學(xué)物經(jīng)呼吸道吸人是工業(yè)毒理學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)中最常見的接觸途徑之一，也是藥品和農(nóng)藥的接觸途徑之一。常用于研究氣態(tài)、蒸氣態(tài)、氣溶膠、煙塵、粉塵狀的外源性化學(xué)物對呼吸道損傷、吸收后對機體損害。可求出吸人接觸的半數(shù)致死濃度（京50），并進(jìn)行急性毒性分級。本實習(xí)的目的是學(xué)習(xí)靜式呼吸道染毒技術(shù)，掌握lc50的實驗步驟和方法。二.原理呼吸道吸人染毒可分為兩種方式，一是動式吸入，一是靜式吸人。其類型又可分為兩種，一是將實驗動物整體置于染毒柜中；一是只將實驗動物的口鼻部位與染毒柜中含受試物的空氣接觸，身體其他部位置于染毒柜外，也稱為面罩吸人染毒。靜式吸入染毒系將實驗動物置于一個一定的體積的密閉容器內(nèi)，加入定量的易揮發(fā)液態(tài)受試化合物或一定體積的氣態(tài)受試化合物，在容器內(nèi)形成所需的受試化合物的空氣環(huán)境。接觸一定時間（一般為2h或4h）后，觀察動物的中毒反應(yīng)，并根據(jù)動物的死亡情況和相應(yīng)的受試物濃度，求出lc50。這種接觸方式，染毒柜的體積與所放置的動物數(shù)量應(yīng)相適應(yīng)，否則會出現(xiàn)缺氧與二氧化碳潴留現(xiàn)象。一般要求在接觸期內(nèi)染毒柜的氧分壓不能低于19%,二氧化碳分壓不能超過％。染毒柜體積、放置動物種類和數(shù)量及放置時間相互關(guān)系見表3。表4-1實驗動物的最低需氣量及不同染毒柜容積應(yīng)放置的動物數(shù)（染毒2h）動物種屬呼吸通氣量最低需氣量不同容積染毒柜放置動物數(shù)（只）(L/h)(L/h)25L50L100L300L1000L小鼠3?56?1012?1536?40120?150大鼠011?25?616?18豚鼠011?25?616?18貓0003?49?10家兔00014?5猴00013?4狗00001（引自:南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院王心如主編.毒理學(xué)實驗方法與技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社.2005,15）染毒柜：有機玻璃制成，現(xiàn)有容積有60L和100L兩種規(guī)格。柜頂蓋部有三個附件。一個是投藥孔，一個是用于混勻蒸氣或氣體的小電扇，一個是插入溫度計的孔。在柜壁上掛有一個小不銹鋼碟為接受和蒸發(fā)液態(tài)受試物的藥物蒸發(fā)器。（見下圖）圖4-1有機玻璃靜式染毒柜.內(nèi)容.靜式呼吸道吸人染毒操作。.毒性體征的觀察和LC50計算。.試劑和材料（一）實驗動物健康成年昆明小鼠60只，體重22-24g，雌雄各半。（二）器材靜式吸入染毒柜有60L和100L）兩種規(guī)格、動物稱（電子天平，感應(yīng)量1000g）、刻度吸管（0.2、0.5、1.0、5.0m1）、洗耳球、動物籠、編號筆。（三）試劑.受試物：苯（分析純）、d=0.878g/ml。.苦味酸酒精飽和液。.操作步驟.小鼠稱重、編號與分組（見實習(xí)二）。.劑量設(shè)計設(shè)6各劑量組，具體方案如下：組別 123456劑量（mg/L） 115靜式染毒多采用計算方法折算染毒柜內(nèi)受試化合物的濃度，易揮發(fā)液體化合物濃度計算式為：a.dC=lx1000式中:C-------實驗設(shè)計受試化合物的濃度（mg/L）;應(yīng)加入受試化合物的量（ml）;d-------受試化合物的比重（g/ml）;L——染毒柜體積（L）.呼吸道吸人染毒將已稱重、編號的小鼠放入染毒柜內(nèi)，加蓋時注意藍(lán)色小蓋帽（為加藥孔）對準(zhǔn)掛在柜臂的小不銹鋼碟（接物蒸發(fā)器）并扣緊，根據(jù)設(shè)計的劑量濃度及染毒柜體積，計算出應(yīng)加入苯溶液的量，用刻度吸管吸取苯溶液并經(jīng)加藥孔加到不銹鋼碟上，接通電源小電扇開啟，計時。觀察、記錄中毒體征和動物死亡情況，按表填寫（參照實習(xí)三的表1）。染毒時間2小時。.LC50計算參照實習(xí)三LD50計算方法進(jìn)行計算。.結(jié)果評定依據(jù)小鼠中毒體征、死亡時間、LC50,參考相應(yīng)的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，判斷該受試物的毒性大小及其毒性特征。表4-2化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級（小鼠一次吸入2小時LC50）毒性分級劇毒高毒中等毒低毒g/ml<~〈~<50)50.實驗報告見經(jīng)口急性毒性試驗實習(xí)要求。.注意事項.注意染毒柜密閉，保持柜內(nèi)受試物濃度，防止污染周圍環(huán)境和影響操作者。.染毒結(jié)束，應(yīng)在啟動的通風(fēng)柜內(nèi)開啟染毒柜，待20分鐘后取出小鼠，活的脫臼處死。.中毒死亡及脫臼處死的小鼠，裝進(jìn)塑料袋（注意不要夾帶任何雜物放進(jìn)塑料袋），集中送到801室，置于冰柜專用紡織袋冷凍貯存待銷毀。實驗五蓄積毒性試驗一、目的蓄積毒性試驗是評價外源化學(xué)物有無蓄積毒性的重要方法。本實習(xí)的目的是了解蓄積毒性試驗的原理，掌握蓄積系數(shù)法。二、原理某些毒物多次以小劑量反復(fù)進(jìn)入體內(nèi)，可表現(xiàn)出機體對該毒物的反應(yīng)性增強，即一次染毒不引起反應(yīng)的劑量，如多次重復(fù)染毒，則可能引起明顯的反應(yīng)甚至死亡。這表明毒物有蓄積毒性。毒物的蓄積與進(jìn)入機體的毒物劑量、重復(fù)染毒間隔時間、毒物的毒性及其代謝特點和機體反應(yīng)特性條件有關(guān)。三、試劑和材料.實驗動物健康成年大鼠或小鼠。.器材注射器、灌胃針、動物體重秤。四、實驗方法采用蓄積系數(shù)法：選用大鼠或小鼠以經(jīng)口灌胃或腹腔注射方法進(jìn)行試驗，先進(jìn)行受試物的急性毒性試驗，求出LD50。然后選取相同條件的動物40只（或更多），隨機分為試驗和對照2組，每組至少20只，雌雄各半。在1/20?gLD50范圍內(nèi)選擇劑量，以相同染毒途徑、定時、定量對試驗組染毒。觀察記錄動物死亡數(shù)。當(dāng)試驗組累積發(fā)生一半動物死亡時終止染毒。累計自實驗開始到出現(xiàn)50%動物死亡時的累積染毒總劑量（工LD50[n]），用公式1計算該毒物的蓄積系數(shù)K值：蓄積系數(shù)K=ELD50[n]/ELD50[1]（公式1）式中ELD50⑴：一次染毒的50%的致死劑量；eld50m:引起動物死亡的累計總劑量。根據(jù)蓄積系數(shù)值，可將毒物的蓄積作用分4級（表5—1）。另外一種測定毒物蓄積系數(shù)的實驗方法是：動物每天按體重給一定劑量的毒物染毒。第1?4天，給ELDs。劑量，然后染毒劑量按倍每4天遞增一次，染毒劑量安排見表5—2。表5—1按蓄積系數(shù)對蓄積作用分級蓄積系數(shù) 分級0? 極強蓄積1? 強蓄積3? 中等蓄積5? 弱蓄積表6—2蓄積試