AccQ-Tag法測氨基酸含量SOP

AccQ-Tag法測氨基酸含量所需設(shè)備及試劑設(shè)備：天平（精度0.1mg）；pH計（精度0.01級）；單標線吸管（50ml）；容量瓶（500ml）；溶劑過濾器及濾膜（0.45μm）；試管（1.5×15cm，1.5×10cm）；樣品管（6×50mm）；微量進樣器（10μl）；微量可調(diào)移液器（20μl，100μl，1000μl）及吸頭；旋渦混勻器；烘箱（55℃HPLC系統(tǒng)及AccQ-Tag柱。試劑：超純水（≥18MΩ?cm）；乙腈（HPLC級）；WatersAccQ-Tag流動相A濃液Waters氨基酸水解液標準（H）；WatersAccQ-Fluor試劑盒（包括硼酸緩沖液1、衍生劑粉2A、稀釋液2B）。流動相A制備：吸取50mlWatersAccQ-Tag流動相A濃液，放至500ml容量瓶中，加超純水至刻度，用0.45μm濾膜過濾后備用。衍生標定標準制備1mmol/L色氨酸標準液：稱取色氨酸（生化試劑）20.4mg，加超純水溶解至100ml。含色氨酸的標定標準：取1支Waters氨基酸水解液標準，打開后吸取1ml，放至一支干凈的1.5×15cm試管中，加2.5ml色氨酸標準液，6.5ml超純水，旋渦混勻，每支Eppendorf管分裝1ml備用。（此標準含有的色氨酸的濃度與其它氨基酸一樣，為0.25mmol/L。）10倍稀釋后的標準可在–20℃保存1個月。剩余的氨基酸水解液標準可在–20℃保存3個月。未啟封的氨基酸水解液標準可在4℃保存1年。使用衍生試劑制備將烘箱預(yù)熱至55±1℃取一瓶衍生劑粉2A，輕輕敲動以確保打開前所有粉末落在瓶底；吸取1ml稀釋液2B并棄去以沖洗一個干凈的微量移液吸頭；（警告：稀釋液2B為乙腈，可燃且有毒，參考安全數(shù)據(jù)表。）移1ml稀釋液2B至2A瓶中，蓋緊瓶蓋，旋渦混勻10秒種；55℃加熱5~10分鐘使衍生劑粉溶解（加熱不得超過10將溶解后的衍生試劑放入干燥器中，可在室溫保存1星期。（注意：衍生試劑遇空氣中水蒸氣易分解。不用時應(yīng)密封。）衍生標準將烘箱預(yù)熱至55±1℃用微量進樣器吸取10μl標定標準至一支干凈的樣品管底部；移70μl硼酸緩沖液至樣品管中，短暫旋渦混勻；移20μl衍生試劑至樣品管中，立即旋渦混勻數(shù)秒種；室溫放置1分鐘；用封口膜封口，55℃加熱5分鐘（加熱使少量的酪氨酸副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為主要的單衍生化合物）。衍生產(chǎn)物可在室溫保存1衍生樣品：一般樣品稀釋60倍，取10μl按3.3.2以下同法操作。衍生應(yīng)與標準同時進行。色譜條件色譜柱：AccQ-Tag氨基酸分析柱（3.9×150mm，4μm）（柱體積：1.8ml）流動相A：見2.，B：乙腈，C：超純水梯度表：T(min)A%B%C%Curve00100.00.00.061791.05.43.662480.017.03.063268.020.012.063468.020.012.06350.060.040.06370.060.040.0638100.00.00.0645100.00.00.06流速：1.0ml/min柱溫：37紫外檢測波長：248nm進樣量：5μl記錄時間：45min測定平衡系統(tǒng)設(shè)柱溫37℃，流速1ml/min如果以前柱用100%乙腈保存，先用乙腈/水（60:40）沖洗5min；如果以前柱用60%乙腈保存，接下一步；用100%AccQ-Tag流動相A平衡柱10min；運行一次空白梯度（二次更好）。進樣：先進標準，后進樣品。上次樣品走完與下次進樣之間相隔應(yīng)不超過3min。沖洗進樣記錄完畢后，關(guān)閉檢測器，繼續(xù)以100%AccQ-Tag流動相A沖洗10min；換100%水沖洗40min以上；如果保存時間為3天或更少時，可用乙腈/水（60:40）沖洗20min；如果保存時間超過3天或不能確定時，用100%乙腈沖洗20min。分別用20ml超純水沖洗柱塞桿外部和法蘭盤上小孔。附錄流動相A配制方法試劑：三水乙酸鈉(GR)、磷酸(AR)、乙二胺四乙酸二鈉(AR)、疊氮鈉(AR)、三乙胺(AR)。稀磷酸制備：取100ml濃磷酸加到100ml超純水中。EDTA溶液制備：稱100mg乙二胺四乙酸二鈉，加100ml超純水，超聲振蕩使其溶解。流動相A（140mmol/L乙酸鈉，17mmol/L三乙胺，pH4.95）制備見下表。（pH一定要準確至0.01）流動相A濃A液1．稱19.04g三水乙酸鈉1．稱190.4g三水乙酸鈉2．加1L超純水，攪拌溶解2．加1L超純水，攪拌溶解3．用稀磷酸調(diào)pH至5.23．用濃磷酸調(diào)pH至5.24．加入1mlEDTA溶液4．加入10mlEDTA溶液5．加入0.1g疊氮鈉5．加入0.1g疊氮鈉6．加入2.37ml三乙胺（1.72g）6．加入23.7ml三乙胺（17.2g）7．用稀磷酸調(diào)pH至4.957．用濃磷酸調(diào)pH至4.958．用水溶性濾膜過濾8．用水溶性濾膜過濾流動相A也可通過稀釋濃A液來制備，制備時，取100ml濃A液與900ml超純水混合均勻即可。濃A液制備見上表。濃A液可在4℃保存6Waters氨基酸水解液標準在0.1mol/LHCl中含有2.5mmol/L的18種氨基酸（胱氨酸為1.25mmol/L，相當于2.5mmol/L半胱氨酸）。配制的含色氨酸的標定標準中各氨基酸的濃度為：NameM.W.C(mmol/L)C(mg/ml)NameM.W.C(mmol/L)C(mg/ml)門冬氨酸133.100.250.03328胱氨酸240.300.1250.03004絲氨酸105.090.250.02627酪氨酸181.190.250.04530谷氨酸147.130.250.03678纈氨酸117.150.250.02929甘氨酸75.0670.250.01877蛋氨酸149.210.250.03730組氨酸155.150.250.03879賴氨酸146.190.250.03655精氨酸174.200.250.04355異亮氨酸131.170.