電鏡教學(xué)病毒

電子顯微鏡技術(shù)

在病毒學(xué)中的應(yīng)用

1精選課件一、概述二、病毒學(xué)研究中所用電鏡樣本制作三、臨床材料的取樣和處理四、病毒的基礎(chǔ)研究2精選課件病毒學(xué)的發(fā)展歷程與電鏡技術(shù)的發(fā)展相輔相成，互相促進(jìn)。一、概述電鏡技術(shù)的發(fā)展對(duì)病毒學(xué)發(fā)展起了極大的促進(jìn)作用。在研究病毒侵入宿主細(xì)胞后，發(fā)生了一系列的變化，又推動(dòng)電鏡技術(shù)從簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)展到一個(gè)動(dòng)態(tài)的示蹤過程。3精選課件

近年來，核酸分子雜交技術(shù)，電鏡的核酸研究技術(shù)進(jìn)展對(duì)病毒的分子生物學(xué)研究起了更大的推動(dòng)作用。

電鏡可直接觀察DNA分子與RNA分子外，還可觀察到某些蛋白質(zhì)與核酸相結(jié)合時(shí)的復(fù)合物4精選課件二、病毒學(xué)研究中所用的電鏡樣本制作技術(shù)

（一）負(fù)染色技術(shù)（二）瓊脂擴(kuò)散技術(shù)（三）假?gòu)?fù)型技術(shù)（四）病毒顆粒免疫電鏡技術(shù)（五）超薄切片電鏡技術(shù)

(六)免疫超薄切片電鏡技術(shù)5精選課件（一）負(fù)染色技術(shù)

負(fù)染色也叫陰性反差染色。

Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用的這種染色技術(shù)。用磷鎢酸（PTA）對(duì)灌木病毒及煙草花葉病毒進(jìn)行染色后，觀察到前所未見的細(xì)微結(jié)構(gòu)。6精選課件1、負(fù)染色的原理

負(fù)染色技術(shù)用重金屬染液里的金屬原子作為電子“染料”，把密度較低的生物標(biāo)本（病毒）包繞而形成明顯反差的方法。電子光束能夠通過低電子密度的病毒顆粒，而不能通過金屬背景，從而使病毒顆粒呈現(xiàn)出明亮清晰的結(jié)構(gòu)，即負(fù)反差。7精選課件在電鏡照片上(與正染色相反)在黑背景中呈現(xiàn)出“白色”的樣品。負(fù)染色技術(shù)目前在病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)研究中最為成功。8精選課件9精選課件

負(fù)染色正染色陰性反差染色陽(yáng)性反差染色細(xì)微結(jié)構(gòu)本身不被染色劑與細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)染色結(jié)構(gòu)周圍染色成分相結(jié)合背景被染色增加標(biāo)本結(jié)構(gòu)本身密度散射電子的能力強(qiáng)增加其散射電子能力樣品周圍成暗色細(xì)微結(jié)構(gòu)呈黑色結(jié)構(gòu)本身成像淺未被染色的背景淺淡10精選課件2、優(yōu)點(diǎn)（1）負(fù)染色技術(shù)反差好，分辨率高（可達(dá)20Ao左右）（2）簡(jiǎn)單易行、快速等優(yōu)點(diǎn)。

在生物學(xué)研究中廣泛的應(yīng)用主要用于細(xì)菌、病毒、分離的細(xì)胞器、核酸大分子、蛋白質(zhì)晶體及其他大分子材料等研究，尤其是在病毒學(xué)領(lǐng)域。11精選課件3.染色劑：

1）較高密度：染色劑應(yīng)具有較高的電子密度和較強(qiáng)的電子散射能力，產(chǎn)生足夠的反差。2）溶解度高：優(yōu)良的染色劑在水中需要有良好的溶解度；染色劑不形成顆粒狀結(jié)構(gòu)或析出結(jié)晶。3）熔點(diǎn)較高：在電子束照射下不升華揮發(fā)；12精選課件4）分子細(xì)小，容易在不規(guī)則的樣品表面滲透到各個(gè)細(xì)微角落；5）與樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；這樣才能客觀地顯示樣品的真實(shí)形態(tài)。凡密度比生物標(biāo)本大4倍以上的金屬溶液均可作為負(fù)染色液；在病毒研究中最常使用：

1-3%磷鎢酸鹽水溶液

0.1-1%醋酸鈾水溶液13精選課件4.負(fù)染色方法：（1）滴染法：樣品懸液滴到有支持膜的銅網(wǎng)上將染色劑溶液滴到樣品上自然干燥后即可電鏡觀察14精選課件（2）漂浮法帶有支持膜的銅網(wǎng)，在懸液樣品的液滴上漂浮再置于負(fù)染液的液滴上漂浮漂浮期間，樣品與染液吸附在銅網(wǎng)的支持膜上待干后電鏡觀察15精選課件（3）噴霧法樣品懸液負(fù)染色液等量混合特制噴霧器噴到帶有支持膜的銅網(wǎng)上待干后電鏡觀察優(yōu)點(diǎn)：霧滴小，樣品分布均勻缺點(diǎn)：消耗較多的樣品及染料易使病毒擴(kuò)散，不常用。

16精選課件標(biāo)本－染液混合染色法：病毒懸液和2％的磷鎢酸染液等量混合用毛細(xì)管滴到有膜的載網(wǎng)上（吸去過多的病毒－染液混合物），待干后進(jìn)行電鏡觀察。一般認(rèn)為病毒濃度在105以上時(shí)不難發(fā)現(xiàn)病毒。17精選課件5.影響因素：1）樣品的純度：

負(fù)染色樣品純度要求不是很高，最好進(jìn)行適當(dāng)純化；樣品雜質(zhì)太多，如大量的細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)?、糖類、各種鹽類結(jié)晶均會(huì)干擾染色效果及電鏡觀察。2）樣品的濃度：

被檢查的樣品要有適當(dāng)?shù)臐舛?。太濃太稀均影響電鏡觀察。18精選課件

3）樣品與染液的均勻分散度

為促進(jìn)樣品與染料的均勻分散提高染色效果，可以采用某些分散劑

4）懸液與染液的酸堿度

一般以中性或略偏酸性（PH6.4－7）為宜。

5）染色時(shí)機(jī)的把握

吸去過多樣品懸液后盡快滴加負(fù)染色液

19精選課件注意：進(jìn)行負(fù)染色觀察樣品，應(yīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，慎重作結(jié)論應(yīng)該做必要的對(duì)照，以排除某些假象20精選課件

（二）瓊脂擴(kuò)散技術(shù)：

檢測(cè)的材料中病毒含量不足時(shí)，為了達(dá)到濃縮病毒的目的，并去除材料中所含鹽分，可采用瓊脂擴(kuò)散法。

用0.8%瓊脂鋪好的瓊脂塊，把含病毒的懸液滴到瓊脂塊上，然后把載網(wǎng)倒懸在這滴懸液上。瓊脂塊把水分吸收，濃縮的病毒沾附在載網(wǎng)上，再經(jīng)過負(fù)染色后進(jìn)行電鏡觀察。

21精選課件（三）假?gòu)?fù)型技術(shù)：

瓊脂或瓊脂糖表面上粘附的病毒顆粒，以假?gòu)?fù)型的形式轉(zhuǎn)移到火棉膠膜上或Formvar膜上。此種方法：能去除標(biāo)本中的鹽分、濃縮病毒；減少不必要的雜質(zhì)；比較費(fèi)時(shí)。22精選課件方法：1）將20%的瓊脂糖塊放到載玻片上，滴上含病毒的懸液，將它放到紫外燈下照射消毒，直到懸液被瓊脂吸干。2）在瓊脂塊的表面加一滴0.5%Formvar溶液，把多余的Formvar用濾紙片吸走。3）用刀片將瓊脂塊的邊緣切除（為便于剝離）輕輕將載有瓊脂塊的載玻片浸入PTA或醋酸鈾溶液中，并把Formvar膜剝離和漂浮到染液水面上。23精選課件4）將銅網(wǎng)放到剝離到水面上的Formvar膜上。5）用不銹鋼小柱把銅網(wǎng)膜同F(xiàn)ormvar膜一起打撈出來，即可進(jìn)行電鏡觀察。24精選課件25精選課件

（四）病毒顆粒免疫電鏡技術(shù)：

病毒顆粒與其外周相伴隨的結(jié)構(gòu)成分雜質(zhì)或人工損傷產(chǎn)物混淆不清。特別是腸道病毒與糞便中成分難以分辨。這種情況需要借助特異性的抗血清（抗體），把病毒顆粒包被、凝聚起來。病毒顆粒經(jīng)過特異性的抗體結(jié)合并凝聚成團(tuán)之后，在負(fù)染色下顯示出病毒結(jié)構(gòu)，或包被在病毒顆粒表面的抗體，形成抗體橋，這種電鏡技術(shù)稱作免疫電鏡技術(shù)（IEM）。26精選課件樣品制備步驟：

取0.9ml病毒懸液加0.1ml1：10稀釋的恢復(fù)期病人血清充分混勻

↓

37℃1小時(shí)后，置4℃冰箱過夜↓然后用瓊脂擴(kuò)散法或假?gòu)?fù)型法制作電鏡標(biāo)本↓負(fù)染色后，電鏡檢查27精選課件根據(jù)抗體凝聚的病毒顆粒的多少和程度以（+）表示如果檢查不到抗體包被的病毒顆粒，可離心，將沉淀重懸浮于1-2滴蒸餾水中，再用同樣方法滴膜、負(fù)染。利用免疫電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定了許多重要的病毒。28精選課件29精選課件（五）超薄切片電鏡技術(shù)：

負(fù)染色電鏡技術(shù)在病毒快速診斷上應(yīng)用最廣，效力較高。

對(duì)于活檢和尸檢所得的組織來說，超薄切片有其獨(dú)到之處。

它不僅可以發(fā)現(xiàn)組織和細(xì)胞中的病毒顆粒，還可以發(fā)現(xiàn)病毒造成的細(xì)胞結(jié)構(gòu)病理變化或病毒的有關(guān)產(chǎn)物（如包涵體等）。30精選課件

取材→固定→脫水→浸透包埋→超薄切片→染色→觀察此法不及負(fù)染方法快速，結(jié)果較為可靠，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。31精選課件32精選課件(六)免疫超薄切片電鏡技術(shù)：

常規(guī)電鏡固定液對(duì)抗原活性有破壞作用，不適于免疫電鏡。采用比較溫和的固定劑進(jìn)行超薄切片酶標(biāo)記免疫電鏡或以低濃度的戊二醛、甲醛混合固定液進(jìn)行免疫膠體金技術(shù)33精選課件三、臨床材料的取樣和處理：

用電鏡進(jìn)行診斷，取材正確與否很重要。（一）皮膚病損：皮膚的病毒病很多，主要是痘皰、軟疣和瘊類例如：?jiǎn)渭儼捳睿↖型，II型）水痘-帶狀皰疹傳染性軟疣（痘病毒科）尋常疣（乳多空科）34精選課件取材方便：病損都在皮膚表面或皮膚粘膜交界處，故采樣方便。易于識(shí)別：這些病毒比較大（除乳多空病毒）具有典型的形態(tài)，易于識(shí)別。35精選課件水皰狀病損：吸取皰液，滴在載網(wǎng)上，經(jīng)負(fù)染色后，電鏡觀察。

（直接取材法）皮膚結(jié)痂和疣類病損：取下病損，加少許蒸餾水研磨成懸液，棄細(xì)胞碎片，過濾、超速離心，取沉淀染色、電鏡觀察。（離心提純法）36精選課件（二）糞便：

病毒性腹瀉、甲型肝炎、小兒麻痹及許多腸道病毒感染性疾病可以從糞便中排出病毒?？贵w--病毒凝集法取材原則：1、發(fā)病早期取材，病毒含量較多；2、取病程中幾份大便，發(fā)現(xiàn)病毒機(jī)會(huì)多；3、收集較多的大便：發(fā)現(xiàn)新病毒需深入研究。37精選課件標(biāo)本處理：糞便用Eagle氏或Hanks液（或生理鹽水）制成10%的原液，為了增加病毒含量，將細(xì)胞殘?jiān)锏牟《救酷尫?，可用超聲波充分振蕩后，?jīng)離心，取上清液做病毒懸液進(jìn)行電鏡檢查。如果電鏡下未發(fā)現(xiàn)病毒，可離心，取沉淀滴加蒸餾水重新懸浮，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散和電鏡檢查。如果有恢復(fù)期病毒的血清，亦可做免疫電鏡檢查。38精選課件

（三）尿液：

經(jīng)超速離心濃縮尿液；再進(jìn)行假?gòu)?fù)型技術(shù)或瓊脂擴(kuò)散等進(jìn)一步濃縮。尿中可檢查到巨細(xì)胞病毒：

孕婦巨細(xì)胞病毒可引起胎兒先天畸形。人乳多空病毒：腫瘤化療和腎移植病人，由于免疫功能抑制，潛伏的病毒被激發(fā)活躍。39精選課件

（四）血清和腦脊液：

我國(guó)乙型肝炎帶病毒率可高達(dá)12%電鏡在發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒中起了重大作用。乙型肝炎病毒40-42nm圓形Dane顆粒，

20-22nm的小圓形顆粒和管狀顆粒都是在電鏡下鑒定出來的。腦脊液中發(fā)現(xiàn)病毒機(jī)會(huì)罕見，電鏡不適于進(jìn)行常規(guī)診斷。40精選課件41精選課件（五）鼻咽分泌物從鼻咽分泌物和洗液中發(fā)現(xiàn)呼吸道病毒（流感、副流感、呼吸道細(xì)胞融合病毒、冠狀病毒等）是可能的,

其中尤以冠狀病毒較易發(fā)現(xiàn)。用電鏡檢查鼻咽分泌物中的病毒，效果較差，必要性不大。42精選課件四、病毒的基礎(chǔ)研究：(一)病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)研究：電鏡技術(shù)\X線衍射技術(shù)在病毒結(jié)構(gòu)研究中起重要作用物理化學(xué)技術(shù)

/病毒的形態(tài)研究則以電鏡技術(shù)最為重要。煙草花葉病毒是最早進(jìn)行電鏡觀察的一種病毒。Kausche等（1939）首次用電鏡證明煙草花葉病毒是一種棒狀顆粒，并測(cè)出它的近似大小，但圖象極不清晰。43精選課件50年代末，由于高分辨率電鏡的出現(xiàn)、負(fù)染色制樣技術(shù)的建立，使電鏡成為目前研究病毒形態(tài)的一個(gè)重要的工具。電鏡觀察不僅可以區(qū)別各種病毒的形態(tài)，而且還可以分辨病毒蛋白質(zhì)外殼的亞基是如何有序的排列。44精選課件1、病毒的基本結(jié)構(gòu)

病毒由核酸和蛋白質(zhì)衣殼構(gòu)成核衣殼某些病毒的核衣殼外面還有一囊膜核酸：

病毒只含有一種核酸DNA或

RNA，可以是單股或雙股。衣殼：由大量的衣殼子粒組成的。衣殼有兩種對(duì)稱形式：二十面體對(duì)稱螺旋對(duì)稱45精選課件囊膜：囊膜含有脂質(zhì)雙層和

具有特殊功能的蛋白質(zhì)。

囊膜蛋白有兩種：

1）糖蛋白：暴露在病毒體外表面，有一個(gè)糖基化的親水末端和一個(gè)保持在脂質(zhì)雙層中的疏水末端

2）基質(zhì)蛋白：電鏡下可見病毒體外表面的糖蛋白是穗狀突起。46精選課件47精選課件2、病毒形態(tài)1）螺旋對(duì)稱的棒狀病毒2）二十面體對(duì)稱球狀病毒3）復(fù)合型病毒裸露的螺旋對(duì)稱型：煙草花葉病毒有包膜的螺旋對(duì)稱型：粘病毒裸露的二十面體立體對(duì)稱型：腺病毒、呼腸病毒、乳多空病毒有包膜的二十面體立體對(duì)稱型：皰疹病毒、白血病病毒復(fù)合型：痘病毒、噬菌體48精選課件棒狀病毒：煙草花葉病毒是棒狀病毒的代表。彈狀病毒或正粘和付粘病毒的核衣殼也是螺旋對(duì)稱。無囊膜的病毒之螺旋對(duì)稱衣殼非常緊密;

有囊膜的病毒之螺旋對(duì)稱衣殼則較柔和，以便能盤繞在囊膜中。電鏡照相可見到螺旋對(duì)稱衣殼的旋轉(zhuǎn)螺旋結(jié)構(gòu)。49精選課件球狀病毒：是一類分布范圍最廣的病毒，包括小DNA病毒、乳多空病毒、小RNA病毒、呼腸孤病毒。所謂球狀病毒實(shí)際具有二十面體對(duì)稱。蛋白質(zhì)亞基組成的球狀衣殼。根據(jù)立方對(duì)稱的原則，二十面體應(yīng)有5，3，2三種對(duì)稱形式。二十面體對(duì)稱衣殼：蛋白質(zhì)單體形成衣殼子粒結(jié)構(gòu)。衣殼子粒在電子顯微鏡照相中可見。50精選課件復(fù)合型病毒痘病毒：病毒體成磚形或卵圓形噬菌體：大腸桿菌T2、T4、T6或λ噬菌體，均有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)頭部和一個(gè)尾部。它們有雙對(duì)稱結(jié)構(gòu)，某些成分具有二十面體對(duì)稱，而有些成分是螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)。51精選課件52