高等植物脂氧合酶活性檢測方法的研究進展

高等植物脂氧合酶活性檢測方法的研究進展

0lox活性物質(zhì)高等植物脂氧合酶（lee1.13.11.12）是一種含有非血紅素鐵的氧合酶（oxygense）。酶蛋白（apollol）由多條多酚鏈組成，金屬離子輔助組的激活狀態(tài)為fe3+，非激活狀態(tài)為fe2+。LOX專一催化具1,4-順-順-戊二烯結(jié)構(gòu)(cis,cis-1,4-pentadienemoieties)的多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,PUFA)的加氧反應,生成不飽和脂肪酸的氫過氧化物(hydroperoxide)。LOX的一級和空間結(jié)構(gòu)決定了其催化專一性及產(chǎn)物的類型;植物LOX第570—580位氨基酸殘基組建的模體(motif)決定其催化位點是C9-位還是Cl3-位,具蘇氨酸-纈氨酸(threonine-valinemotif,TV)模體的LOX表現(xiàn)為9-LOX活性,具蘇氨酸-苯丙氨酸(threonine-phenylalanine,TF)模體或其他結(jié)構(gòu)的LOX表現(xiàn)為13-LOX活性。LOX的植物亞細胞定位具有多樣性。葉綠體(chloroplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(pusule)、微體(microbody)、脂質(zhì)體(liposome)、質(zhì)膜(plasmamembrane)及胞漿(cytoplasmicmatrix)都曾發(fā)現(xiàn)LOX的存在,如黃瓜(Cucumissativus)LOX既以可溶性的形式存在于胞漿和液泡中,也可以以跨膜蛋白(transmembraneprotein)的形式存在于脂質(zhì)體膜(liposomemembrane)和質(zhì)膜(plasmamembrane)上。LOX有多種生理功能。(1)合成活性物質(zhì)。LOX催化反應的初產(chǎn)物脂肪酸氫過氧化物存在2條代謝途徑,一條最后形成創(chuàng)傷激素(traumatin),該物質(zhì)參與植物對傷害的反應,另一條的終產(chǎn)物為茉莉酸(jasmonicacid,JA),JA及其甲酯對植物的種子萌發(fā)、生長及抗逆反應等起重要的信號作用。(2)參與植物衰老。LOX催化脂質(zhì)過氧化(lipidperoxidation)過程中,有一個產(chǎn)生自由基(freeradical)的階段,自由基和氫過氧化物能增加膜透性而加速細胞衰老。(3)參與烤煙(Nicotianatabacum)等農(nóng)產(chǎn)品揮發(fā)性風味、香味物質(zhì)的形成。LOX催化生成的氫過氧化物可進一步降解成小分子醛(aldehyde)、醇(alcohol)等揮發(fā)性物質(zhì),該過程既是豆制品產(chǎn)生腥味的原因,也是某些農(nóng)產(chǎn)品風味及香味物質(zhì)的來源,如LOX催化亞油酸(linoleicacid)、亞麻酸(linolenicacid)氧化形成的己烯醇(hexenol)、己烯醛(hexenal)等可使烤煙(N.tabacum)、豌豆(Pisumsativum)、大豆(Glycinemax)等具備特殊香味。LOX影響植物的生長、發(fā)育、衰老及抗逆反應,并在烤煙(N.tabacum)等農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)形成中起關(guān)鍵作用,所以,快速、經(jīng)濟、靈敏地測定LOX活性至關(guān)重要。2005年,梅伏生等總結(jié)了部分LOX活性檢測方法的原理和優(yōu)缺點;2007年,劉淵等比較了LOX活性檢測部分方法的優(yōu)缺點和應用范圍。本文進一步系統(tǒng)概括了高等植物LOX活性測定方法的研究進展,旨在為特定高等植物LOX活性的高效、準確測定提供參考。1通過lox促進反應中氫氧化的生成速度來測量參數(shù)1.1lox活性的變化自1932年LOX被首次報道以來,基于對LOX底物屬性的知識,最早于1940年出現(xiàn)的LOX活性測定方法為胡蘿卜素脫色(漂白)(carotenebleaching,CB)法(表1)。該法原理為:LOX催化產(chǎn)生的過氧化氫基可與β-胡蘿卜素反應產(chǎn)生無色的β-胡蘿卜素環(huán)氧化物(epoxides),故檢測反應液在452nm吸光值的變化即可推算LOX活性。1940年,SUMNER等用該法以胡蘿卜素的褪色速度測定了大豆(G.max)LOX粗酶液的活性。但是,因胡蘿卜素在水溶液中的溶解度較低而限制了此法的運用。1971年,AZIZ等通過用Tween-80對亞油酸鹽和胡蘿卜素進行乳化而解決了胡蘿卜素在水溶液中的溶解度低的問題,大大提高了CB法的實用性。后來,KIKUCHI等用此法檢測了大豆(G.max)的LOX活性,并建立了篩選大豆(G.max)子葉(cotyledon)LOX基因(LOX)缺失突變體的胡蘿卜素漂白比色法,該法后來被用于耐儲藏水稻(Oryzasativa)品種的快速篩選。CB法的優(yōu)點是,因所用底物在不同pH范圍內(nèi)都有很好的溶解性,故可用于探索pH對特定植物LOX活性的影響。但是,LOX不同同工酶(isoenzyme)的氧化能力差異和有限的靈敏度均使CB法應用受限,如LOX-1僅在低氧或無氧條件下有活性,LOX-2卻在任何條件下活性都很低;目前,該法主要用作精確度要求不是特別高的LOX活性的快速測定。1.2lox-2活性的檢測Fe(CNS)3顯色法在CB法后問世(表1),其原理為:LOX催化產(chǎn)生的過氧化氫基能氧化Fe(CNS)2生成有色化合物,故可通過比色法檢測LOX活性。1943年,BALLS等用此法檢測了大豆(G.max)LOX粗酶液和經(jīng)初步純化酶液的活性;1958年,KOCH等用此法研究了底物對LOX活性檢測效果的影響;2004年,KIM等用此法檢測到脫腥大豆(G.max)種子LOX-2的存在。Fe(CNS)3顯色法有簡便、可連續(xù)測定等優(yōu)點,但是,該法中生成的有色物質(zhì)不是很穩(wěn)定,且有色物質(zhì)的吸光值與Fe(CNS)3量間缺乏良好的線性關(guān)系,因此,近年此法常用于LOX同工酶的定性檢測、LOX同工酶缺失突變體篩選等。1.3lox-射線氧合酶活性的測定標準分光光度法(standardspectrophotometricmethod)即大部分文獻所述的分光光度法于1946年問世(表1),其原理為:具共軛雙鍵(conjugateddoublebond)的氫過氧化物在234nm處有特征吸收峰,故通過測定反應體系在該處的吸光值可檢測共軛二烯(conjugateddienes)的生成量、進而推算LOX酶活性。該法自1946年問世以來,SURREY和AXELROD等分別對該法在反應條件等方面做了重大改進,該法現(xiàn)已成為實驗室LOX活性測定的標準方法。標準分光光度法也有快速、簡便和易于連續(xù)測定的優(yōu)點,故應用廣泛。但在測定過程要嚴格控制反應溫度和時間,并保持反應體系均相(homogeneousphase),該法不適于濁度(turbidity)較高的LOX粗酶液活性的測定。1.42lox活性的測定2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituricacid,TBA)顯色法于1966年問世(表1),其原理為:氫過氧化物能與TBA結(jié)合、生成黃或紅色加合物(bulkyadducts),故通過檢測反應體系在480nm處吸光值變化可推算LOX活性。1966年,RHEE和WATTS用此法測定了植物根(root)、塊莖(stemtuber)等器官的脂質(zhì)氧化電位(lipidoxidationpotential),以反映LOX活性;同年,RHEE等又將該法成功用于冷凍蔬菜LOX活性的檢測。2-硫代巴比妥酸顯色法具有可連續(xù)測定的優(yōu)點,但易受Fe2+、Fe3+、Cu2+等離子的干擾;該法現(xiàn)主要用于食品如冷凍蔬菜、脫脂豆粉(defattedsoybeanflour)LOX活性的檢測,并被作為食品儲藏中質(zhì)量控制的重要方法之一。1.5間接測定lox活性碘化鉀-淀粉(potassiumiodide-starch,KI-S)法問世于1986年(表1),其原理為:氫過氧化物在酸性條件下氧化I-形成I2,后者與淀粉結(jié)合顯色、在470nm處的吸光值與生成的I2量呈線性相關(guān),因而可間接測定LOX活性。1986年,WILLIAMS等用此法檢測了沒有燙漂過的水果、蔬菜的LOX活性,但沒有在含類胡蘿卜素(carotinoid)的樣品中檢測到LOX活性;2009年,IASSONOVA等用此法檢測了去LOX大豆(G.max)殘留LOX-1的活性。碘化鉀-淀粉法符合食品加工中快速、簡單測定LOX活性的要求,并因測定體系具備肉眼可辨的特征顏色而特別適于LOX的定性分析。但該法靈敏度較低,且不適用于檢測胡蘿卜(Daucuscarota)和番茄(Lycopersiconesculentum)等色素含量較高蔬菜的LOX活性。此外,該法操作中反應試劑極易氧化而造成干擾,故必須嚴格控制反應時間。1.6lox活性的檢測二甲苯酚橙法(ferrousoxidation-xylenolorangemethod,FOX)問世于1995年(表1),其原理為:氫過氧化物可將Fe2+氧化為Fe3+,后者與二甲苯酚橙鹽形成的二甲苯酚橙-鐵(Ⅲ)(ferric-xylenolorange,XO/Fe3+)絡合物在560nm處有特征吸收峰,故據(jù)反應體系在560nm處吸光值的變化可推算LOX活性。1995年,WASLIDGE等分析了FOX法的特性,認為該法適用于多種LOX活性的檢測;2005年,VEGA等從“醇水比(methanol/waterratio)”、溶劑“除氣率(degassingratio)”等方面對該法進行優(yōu)化后成功用于大豆(G.max)LOX活性的檢測;2009年,FUKUZAWA等進一步改進該法,即通過加入膜狀磷脂酰膽堿(phosphatidyl-choline,PC)、形成高鐵二甲苯酚橙-PC(ferric-xylenolorange-PC,XO/Fe3+-PC)絡合物,該物質(zhì)在610nm處有最大吸收而大大提高了二甲苯酚橙法的靈敏性。FOX法具方便、快速、重復性好等優(yōu)點,且生成的有色物很穩(wěn)定,特別適用于LOX活性抑制劑的高通量篩選。2通過lox促進中低產(chǎn)量反應的溶脹率來測量參數(shù)2.1lox活性的檢測量壓法(manometricmethod)也叫Warburg呼吸儀法,問世于1944年(表1),其原理為:LOX催化的反應耗氧,使一定體積的密閉體系內(nèi)的O2量減少、恒溫條件下體系的氣體總壓下降,故據(jù)密閉體系的氣體壓力變化值、用氣體方程可計算出反應的耗氧量,進而推算LOX活性。1944年,THEORELL等發(fā)現(xiàn),此法檢測LOX活性的過程中O2吸收量與LOX活性間不具備良好的比例關(guān)系;但SHASTRY等于1975年、倪培德等于1991年分別報道了用該法檢LOX活性取得了較好效果;2000年,該法檢測硬粒小麥(Triticumaestivum)LOX活性的過程得到了詳細描述。量壓法的優(yōu)點在于,因測定參數(shù)與反應體系濁度無關(guān),故既適用于LOX純酶也適用于LOX粗酶活性的檢測。但該法檢測過程耗時長達30min以上,非LOX催化的耗氧反應,如脂肪酸的α-氧化、粗提物中非脂類物質(zhì)的氧化等,均對檢測結(jié)果影響較大;此外,運用該法必須嚴格保持體系密閉恒溫。2.2lox活性的檢測氧電極法(oxygenelectrodemethod)問世于1967年(表1),其原理為:底物濃度一定時,在一定時間內(nèi),反應溶液里O2濃度減少的速率與LOX活性成正比,故通過用氧電極測定O2的濃度變化可推算LOX活性。1967年,MITSUDA等用該法檢測大豆(G.max)的LOX活性;1979年,GROSSMAN等對該法進行改進,使之成為實驗室中LOX活性的另一標準檢測法,現(xiàn)已廣泛用于精密度較高的LOX活性檢測中。此外,基于該法的集數(shù)據(jù)處理和LOX活性檢測于一身的、適應工廠化生產(chǎn)的臺式設備研制也取得初步進展。氧電極法的優(yōu)點是可連續(xù)記錄反應進程、靈敏度高,且不受反應體系濁度的影響,特別適用于LOX純酶和粗酶的動力學(kinetics)研究。但是,該法在測定操作中需嚴格控制反應系統(tǒng)的溫度和氣密性,對儀器要求較高,這在一定程度上影響了此法在一般試驗和生產(chǎn)中的應用。2.3lox活性的檢測亞甲基藍染色(漂白)法(methylenebluebleachingmethod,MBB)問世于1992年(表1),其原理為:亞甲基藍作為氧化還原指示劑在溶液中的褪色速度與LOX催化反應體系氧化還原電位(oxidation-reductionpotential,ORP)的變化速度在一定時間內(nèi)呈線性關(guān)系,而ORP的下降速度又取決于LOX活性,故通過測定反應體系在660nm處的吸光值變化可衡量體系中亞甲基藍的褪色速度,進而推算LOX活性。1992年,TOYOSAKI首先提出亞甲基藍可作為LOX活性的指示劑。目前,該法已成功用于甜玉米(sweetcorn)等植物材料在燙漂過程中LOX滅活效果的追蹤、LOX同工酶活性的分別檢測。亞甲基藍染色法簡單、快速、靈敏度高,可分別測定LOX-1和LOX-2活性,故適用于LOX同工酶活性的大規(guī)模檢測。3其他方法包括檢測洛氏活性3.1lox-1和lox-3活性的檢測酶聯(lián)免疫法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)用于檢測LOX活性最早始于1982年(表1),YABUUCHI等發(fā)現(xiàn)LOX-1活性與通過ELISA測得的酶蛋白濃度具有一定線性關(guān)系,于是通過親和色譜法(affinitychromatography)純化LOX-1和LOX-3作為抗原(antigen),經(jīng)免疫獲得抗血清(antiserum),并利用ELISA定量檢測LOX-1和LOX-3活性;1993年,DROILLARD等用此法檢測LOX含量,發(fā)現(xiàn)在番茄(L.esculentum)果實由綠變紅的過程中,LOX活性與含量的比值逐漸下降。近年來,此法主要用于LOX同工酶類型的篩選及酶的定位分析。3.2lox超弱光照變化超弱發(fā)光發(fā)射光譜法(superweakluminescenceemissionspectrumassay)用于檢測LOX活性最早始于1982年(表1)。超弱發(fā)光又稱低水平化學發(fā)光(chemiluminescence,CL)是生物體普遍存在的現(xiàn)象。對于植物,LOX對亞油酸的催化是超弱發(fā)光的重要來源,故通過測定植物體的超弱發(fā)光變化可推算LOX活性。1982年,LILIUS等通過偶聯(lián)化學發(fā)光探針(chemiluminescentprobe)即發(fā)光氨(luminol,又稱氨基苯二酰一肼)與LOX催化的脂質(zhì)過氧化反應放大了CL信號,借此建立了基于CL的LOX檢測方法,但發(fā)光氨提高以CL檢測LOX活性的靈敏度的作用直至1999年才被進一步證實。1992年,KONDO等用CL-HPLC系統(tǒng)檢測被真菌(fungus)侵染后大豆(G.max)苗期LOX活性的變化。1997年,蘇震等通過生物體系超弱發(fā)光動力學分析研究了LOX缺失體大豆(G.max)苗期子葉(cotyledon)和真葉(euphylla)的超弱發(fā)光變化,為直接鑒定植物活體材料的LOX同工酶缺失體奠定了基礎(chǔ)。超弱發(fā)光發(fā)射光譜法優(yōu)點在于可對植物活體材料直接進行LO