real-time-pcr-絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)

分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)江燕瓊real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件提綱：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

數(shù)學(xué)原理化學(xué)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法應(yīng)用絕對(duì)定量相對(duì)定量定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素平臺(tái)定量PCR儀器介紹提綱：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義：

與普通PCR的區(qū)別

普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。

與普通PCR的區(qū)別

real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件

定量PCR的數(shù)學(xué)原理

定量PCR的數(shù)學(xué)原理

real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件

斜率與擴(kuò)增效率

斜率與擴(kuò)增效率real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen

特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen法1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲線分析

SYBRGreen熔解曲線分析

SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對(duì)DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA

使用方便--不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)2、TaqMan探針法

2、TaqMan探針法

TaqMan作用機(jī)理

TaqMan作用機(jī)理

TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

Real-timePCR方法應(yīng)用real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件?絕對(duì)定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原體檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)基因表達(dá)研究?相對(duì)定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同組織中的表達(dá)差異藥物療效考核耐藥性研究real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件

絕對(duì)定量與相對(duì)定量的定義

絕對(duì)定量與相對(duì)定量的定義

絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：?含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對(duì)定量：從熒光到拷貝數(shù)

絕對(duì)定量：從熒光到拷貝數(shù)

相對(duì)定量通過內(nèi)標(biāo)定量

內(nèi)標(biāo)（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量

相對(duì)定量通過內(nèi)標(biāo)定量

相對(duì)定量：參照因子Calibrator

相對(duì)定量：參照因子Calibrator

相對(duì)定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計(jì)算表達(dá)水平比率：

2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值

相對(duì)定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)

相對(duì)定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同

待測(cè)樣品目的基因濃度

待測(cè)樣品內(nèi)參基因濃度

F=

對(duì)照樣品目的基因濃度對(duì)照樣品內(nèi)參基因濃度

相對(duì)定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效

定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素

樣品

●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之間●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1uL

樣品

標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法

標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法

復(fù)管測(cè)試●樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)●重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求real-time_pcr__絕對(duì)定量和相對(duì)定量課件平臺(tái)PCR儀介紹ABI7500fast特征：使用96孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動(dòng)）Rn=Normalization=Reporter/Referenc平臺(tái)PCR儀介紹ABI7500fast特征：Rotorgene6500HRM特征：36孔(普通透明0.2m