微管實(shí)驗(yàn)protocol中文版

TUbulinPolymerizationAsssiyKit(Cytoskeleton-Cat.#BK011P)^—Control3yMV—PMlilwllime{s)nuclccticxiLLgrewth一、微管體外聚合實(shí)驗(yàn)^—Control3yMV—PMlilwllime{s)nuclccticxiLLgrewth分為3個(gè)時(shí)相，成核期.生長期、平臺期。Paclitaxel會消除成核期并增加生長期的Vmax,而Nocodazole則導(dǎo)致Vmax減少和聚合雖減少。微管蛋白(tubulin)III55kDa的aB微管蛋白組成，真核中保守，故采用豬腦提収。tubulm聚合時(shí)先形成proto-filaments再形成microtubules□組分描述Bufierl(Part#BP01)2管?干粉?每管加10nxL超純水配成l^bufier.包括組分描述Bufierl(Part#BP01)2管?干粉?每管加10nxL超純水配成l^bufier.包括80mMPIPES.2niMMgCh.0.5mMEGIA?pH6.9?10pM熒光報(bào)告星團(tuán)GTPstock(Cat.#BST06-001)3管.干粉.每管加入100j.iL滅菌水配成1OOniMstocksolutionTAulm蛋a(Cat.#T240-DX)含有10mg凍干微管蛋口.從豬腦純化.>99%純度.白色粉末TAulmGly:erolBufier(Cat.#BST05-001)1管.10mL,包括SOmMPIPES.2mMMgCh?0.5mMEG7A?60%甘油.pH6.9Paclitaxel(CatttTXDOl)1管.干粉.加入IOOmLDMSO配成2mM母液DMSO1管?lmL?配制Paclitaxel用Halfarea96wellplate1塊.黑.平底.CoiiungCostarCat.?3686IIIsteedyQ^ti:LibriuTi二、試劑盒組成三、試劑盒重構(gòu)(-80度保存6個(gè)月)1、Buffei1(Part#BP01)：每管加10ml超純水，2管混勻，13X1.5mU管分裝(2mLEP管〉2、GTPStock(Cat.#BST06-001)：每管加100山滅菌水,3管混勻■13X20^L/管分裝(0.5mLEP管)Tubulin蛋白(Cat.#T24O>DX)：a、將12個(gè)標(biāo)有"tubulinstock,10mg/mLM的凍存管置于冰上預(yù)冷b、20jiL(1管)100mMGTPstock冰上解凍，將15pL的100mMGTPstock與1.5mL(1管)冰預(yù)冷的Buffer1混勻，取l.lmL的Buffer1(含GTP)重懸Tubulin粉末，冰上放豐2分鐘以徹底重懸c、12XS8HL分裝，忙液氮中瞬間冷凍(dropfreeze)后于-SD度保存，每管可用于6-S個(gè)assay4、Paclitaxel(Cat.#TXD01)：加入100吐的DMSO5、TubulinGlyceiolBuffer(CushionBuffer)(Cat.#BST06-001)：無需重構(gòu)，4度保存四、使用步驟1、儀器設(shè)世為動態(tài)讀值，1分鐘1讀共6D分鐘(有時(shí)可縮為30分鐘)，激發(fā)波長360nni/發(fā)射波長450mn,當(dāng)scale最大值為120時(shí)gain設(shè)為80,每孔讀值3次，integration設(shè)置為(MOps,振動設(shè)為5s(Medium,orbital-firstreadonly?),板子使用ComingCostar96-wellplate(ComingCostar,Cat.#3686)。將100|iL的］0倍稀釋的buffer1加入每孔中并激活NeyTenplateScanProcedurec2、將96孔板(ComingCostar.Cat#36S6)世于酶標(biāo)儀中，37度預(yù)熱10分鐘。3、將paclitaxel母液解凍,5卩1加入32泌滅菌水，得30p.Mpaclitaxel(10X母液人使用前置室溫。4、化合物配成2mM母液再水中稀釋成10X母液,10mM化合物1：100至水再1：10至測活體系成10mM。5、直到化合物準(zhǔn)備好了再開始下面的實(shí)驗(yàn)。6、1.5mL(1管)的Bufferl解凍后置于冰上。7、20|iL(1管)的GTPstock解凍后置于冰上。8>將TubulinGlycerolBuffer從4度収出垃于冰上。9、88nL(1管)tubulin(880^g,即10mg/mL)醫(yī)篁祖水浴中迅速解凍后置于冰上|以免微管聚合。

10、速將Bufferl>TubulinGlycerolBuffer>GTPstockTubulinStock按下表制成反應(yīng)液，冰上可放lh。ComponentStandardConditionsInhiiitorDetectionEnhancerDetectionFinalConcentration共444?4pl可用于8個(gè)孔Buffer1243nL205pL（丄管）7355j.iLIXTubulinGlycerolBuffer112pL150HLNoneVanesGTPstock（100mM）4.4pL4.4pL（丄管）444j.iLlmMTubulinstock（1Onig/mL）85nL85pL（1管）35pL2nig/niL11、兩副孔，5吐對照buffer（與溶解化合物的buffer—致）加入A1&BL5（11的lOXpaclitaxel加入Cl&D1.5山的10X測試的化合物加入E1&F1,直到所有化合物加完。12、將加有l(wèi)pl化合物的板子放于酶標(biāo)儀預(yù)熱1分鐘（不得超過1分鐘以免蒸干九13、96孔板每孔加入50g的反應(yīng)液，要快口使用適當(dāng)速度貼孔壁排液以避免產(chǎn)生氣泡。14、立刻讀數(shù)，如果開始后5分鐘內(nèi)出錯(cuò)可重新讀數(shù)。五、注童事項(xiàng)注1：lOXinhibitor陽性對照：5“L的5mM氯化鈣溶液或30^tMNocodazole/vinblastine（長春堿）/colchicine（秋水仙素）：10Xenhancer陽性對照：30|iMPaclitaxel,kit中初始濃度為2mMo注2：8個(gè)孔內(nèi)可單道加，1分鐘加完：超過8個(gè)孔需排槍加：隨中快速且貼著孔壁較低的位萱艇避免產(chǎn)生氣泡，可用2mg/mL的BSA蛋白溶液練習(xí)注3：標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系包括2mg/mL微管，80mMPIPESpH6.9,2.0mMMgCl2>0.5mMEGTA,l.OmMGTP和15%||-；l!|o|要優(yōu)化對inhibitor的檢測采用20%甘油，檢測enlumcer則采用15%甘油注4：儆管必須放冰上直到加入96孔板云藥在加入微管前pB|96孔板。初忑返物怖匿孟栄注5：微管要在分裝前在|液氮中速凍|后再世于-SO度甌保存:且凍存前微管蛋白濃度要慶于6mg/mL|°初忑返物怖匿孟栄注6：測活標(biāo)準(zhǔn)條件是|2mg/mL微管+lmMGTP+15%甘油的Buffer斗腥進(jìn)解聚|采用更高濃度微管蛋白產(chǎn)生高信號：促進(jìn)聚合|不用/用低濃度甘油有助于檢測，如不加甘汕微管不會聚合而paclitaxel則會促進(jìn)聚合。如果要找通過結(jié)合微管疏水口袋而促進(jìn)微管解聚化合物則可不加甘油并增加微管含雖或者使用MAPs（不是通過與微管疏水口袋結(jié)合而定通過離子性結(jié)合九注7：1個(gè)單位的微管（lOOng,5兔L）加入1個(gè)孔，于30分鐘后達(dá)最大熒光值（強(qiáng)度增3V倍）。六、Troubleshooting技術(shù)支持：tservice@cytoskeletoncom問題解決方案沒有聚合1）340?360nm（激發(fā)）.410-460nm（發(fā)射）2）動態(tài)讀值.30s-lnun讀一次數(shù)值波動1）所有步驟嚴(yán)格遵守.CV值在11%2〉需要GTP的buffer冰上放置時(shí)間不超過4h?超過4h后丟笫不可垂復(fù)使用實(shí)驗(yàn)間的不一致的聚介結(jié)果1〉做管蛋口失活.可能由不正確凍存導(dǎo)致:10mg/niL濃度微管于液氮中速凍且不可凍融使用：保存時(shí)蛋口濃度要高于6mg/mL：干粉受潮所致2）聚合時(shí)嚴(yán)格控制在刃度.測活前96孔板