rrhpi-pqe40ecolim15高效表達系統(tǒng)的建立及發(fā)酵條件優(yōu)化

rrhpi-pqe40ecolim15高效表達系統(tǒng)的建立及發(fā)酵條件優(yōu)化

廣泛用于構建互補基因的細菌，并獲得大量外源基因的產物。用質粒pQE-40構建了(His)6-Arg-Arg-人胰島素原[(His)6-Arg-Arg-humanproinsulin,RRhPI]的大腸桿菌表達系統(tǒng)。RRhPI經過復性酶切等下游純化工藝可加工成具有天然生物活性的重組人胰島素。因此,探索在重組大腸桿菌中外源基因RRhPI表達的發(fā)酵工藝,使之高密度、高產率和高濃度培養(yǎng),最終得到高表達的RRhPI,是提高重組人胰島素產率的方法之一。實現基因工程菌的工業(yè)化生產,除了構建高效的載體-宿主系統(tǒng)外,基因工程菌的發(fā)酵過程控制也十分重要。為此,特采用正交優(yōu)化工藝探索了基因工程菌(RRhPI-pQE40E.coliM15)高密度發(fā)酵的影響因素和發(fā)酵工藝。1實驗部分1.1微生物E.coliM15及質粒pQE-40(QIAGEN),胰蛋白胨(Oxoid)和酵母浸出汁(上海棱光酵母制品有限公司);氨芐青霉素(華北制藥股份有限公司);卡那霉素(AMRESCO分裝);異丙基-β-D-巰基吡喃半乳糖苷(IPTG,BBI分裝);低分子量蛋白標準(上海東風生物技術有限公司);其余為國產分析純。1.2rrhpi-pqe-colim15濕菌體的制備1.2.1重組體RRhPI-pQE40E.coliM15的構建及篩選以人胰腺cDNA文庫為模板,特定設計的寡核苷酸段鏈為引物,PCR擴增hPI的編碼序列;hPI基因pQE-40質粒分別被限制性內切酶BamHI和HindⅢ同時酶切產生黏性末端;在低溫(16℃)條件和T4DNA連接酶的作用下,hPI基因和pQE-40質粒通過黏性末端互補形成重組DNA;重組DNA轉化E.coli感受態(tài)細胞M15。隨機挑取轉化單克隆,在LB/AK培養(yǎng)基(氨芐青霉素100μg·ml-1和卡那霉素50μg·ml-1)中進行培養(yǎng),用0.5mmol·L-1IPTG誘導表達。1.2.2細菌的搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)水平下,用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基和比濁法測RRhPI-pQE40E.coliM15的生長曲線。用接種環(huán)挑取斜面保存的RRhPI-pQE40E.coliM15一環(huán)接種于3mlLB/AK培養(yǎng)基中,37℃,220r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間。取100μl菌液接種于5mlLB/AK培養(yǎng)基中,37℃,220r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間即可?；罨姆N子可在4℃下保存數周待用。將5ml活化種子轉接到50ml優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間。取50ml經一級發(fā)酵擴培后的菌液轉接到500ml發(fā)酵培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間后加入IPTG誘導人胰島素原的表達,繼續(xù)恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間后結束發(fā)酵。3×103r·min-1離心15min,沉淀即得RRhPI-pQE40E.coliM15濕菌體,于-20℃保存。采用正交法,結合搖瓶發(fā)酵工藝的前期研究,選取搖瓶培養(yǎng)條件中7個主要因素進行兩水平正交優(yōu)化,7個因素為種子活化方式、搖床轉速(通風量)、IPTG誘導溫度、接種量、IPTG添加量、誘導時間和補料方式。以每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量及發(fā)酵液的A600為目標量考察條件優(yōu)化的效果。選用L8(27)安排,進行8次實驗,對實驗結果進行分析,優(yōu)化出最佳實驗條件,并做3次水平重復試驗,分別測定每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量、發(fā)酵液的A600及每升培養(yǎng)基收獲包涵體的量。IPTG誘導基因工程大腸桿菌表達RRhPI。對誘導時間的影響進一步做了分析,基因工程菌在三角搖瓶培養(yǎng)至對數生長中期,加入0.5mmol·L-1IPTG進行誘導,每隔1h取樣,以SDS分析RRhPI的表達情況。1.2.3細胞的2種破碎方法其一是溶菌酶/超聲破碎細胞。發(fā)酵所得RRhPI-pQE40E.coliM15濕菌體,懸浮于適量緩沖液A(50mmol·L-1Tris-HCl、0.5mmol·L-1EDTA、50mmol·L-1NaCl、5%甘油、0.1～0.5mmol·L-1DTT、pH7.90)中,加入溶菌酶(5mg·g-1濕菌體),室溫或37℃振蕩2h。在冰浴中超聲(10s×30),每次間隔20s,功率200W。其二是超聲破碎細胞。大腸桿菌濕菌體懸浮于適量的緩沖液A中,充分溶解,冰浴超聲(40s×10),每次間隔30s,功率200W。兩種破碎方法所得包涵體洗滌后作SDS。洗滌時均先后用含2mol·L-1尿素的緩沖液和含2%脫氧膽酸鈉(DOC)的緩沖液各洗滌1次,最后用10mmol·L-1Tris-HCl清洗兩次。1.2.4包涵體的3種洗滌方法溶菌酶/超聲破碎細胞的裂解液于4℃、1.4×104r·min-1離心15min,收集沉淀。洗滌方法一是將此沉淀用2mol·L-1尿素的緩沖液充分溶解,離心收集沉淀;沉淀再用2%DOC的緩沖液洗滌,離心,所得沉淀用10mmol·L-1Tris-HCl清洗2次,即得包涵體,于-20℃保存。方法二則用緩沖液充分洗滌沉淀兩次,收集沉淀保存。方法三用2%DOC的緩沖液洗滌1次。再用10mmol·L-1Tris-HCl清洗兩次,離心收集沉淀保存。取上述不同方法洗滌的沉淀,用SDS檢測洗滌效果。1.3結果1.3.1rrbol-pqe40的rr公式用于構建1.3.2rrhpi-pqe.colim15在iptg的誘導表達在搖瓶培養(yǎng)水平下,采用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵RRhPI-pQE40E.coliM15,培養(yǎng)4h后即進入對數生長期,而且對數生長期可延至17h。采用優(yōu)化出的最佳實驗條件做3次平行驗證試驗。結果見表1。綜合每升培養(yǎng)基所收獲濕菌體的量(wetweight/g·L-1)和發(fā)酵液的A600兩個指標,選取關鍵因素的最優(yōu)條件,結果表明搖床轉速(即通風量)與補料方式對發(fā)酵結果影響最大,IPTG的誘導時間和添加量次之。正交試驗所得菌體經溶菌酶/超聲破碎細胞后得到的包涵體SDS的結果見圖3。RRhPI-pQE40E.coliM15表達的外源蛋白(His)6-Arg-Arg-人胰島素原以包涵體形式存在,其分子大小約為13kD,由圖3可知,在正交實驗條件下2、3、7、8包涵體的表達量較高。RRhPI-pQE40E.coliM15在搖瓶中培養(yǎng)至對數生長中期,加入0.5mmol·L-1IPTG進行誘導,每隔1h取樣,以SDS分析RRhPI的表達情況(圖4)。結果RRhPI-pQE40E.coliM15在IPTG誘導4～5h時,富含包涵體的濕菌體(約24kD)收率較高,相應的目的蛋白表達量較高,繼續(xù)誘導并未使?jié)窬w表達量有所提高。因此,誘導3.5～4h既有利于富含包涵體的濕菌體及目的蛋白的表達,又可縮短發(fā)酵時間,簡化生產工藝。2.3細胞破碎方法我們比較了溶菌酶/超聲破碎細胞和超聲破碎細胞兩種方法,并進一步比較了3種包涵體的洗滌方法(圖5)。結果說明“1.2.3”項中破碎方法一較好,即用溶菌酶和超聲破碎結合可徹底破碎細胞,并使表達產物包涵體充分溶出?！?.2.4”項中方法一的洗滌效果優(yōu)于方法二和三,即采用變性劑2mol·L-1尿素及離子型去污劑2%DOC洗滌的效果較好。3發(fā)酵罐培養(yǎng)的菌株活性及菌體表達利用基因重組技術構建的基因工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝,生物工程菌發(fā)酵的目的是希望獲得大量的外源基因產物,盡可能減少宿主細胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表達不僅涉及宿主、載體和目的基因三者的相互關系,而且與其所處環(huán)境的條件也密切相關。因此,需要對影響外源基因表達的因素進行分析,探索適合外源基因表達的發(fā)酵工藝。重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵,可降低生產成本,提高生產效率。我們通過對RRhPI-pQE40E.coliM15發(fā)酵條件的優(yōu)化,發(fā)現搖床轉速與補料方式對發(fā)酵結果影響最大。搖床轉速與發(fā)酵過程中氧氣的供給有直接的關系,轉速越高,越能滿足高密度發(fā)酵中工程菌劇烈生長繁殖所需的氧氣量;及時補料則可相對延長工程菌的對數生長期,從而增加菌體數量,達到高密度發(fā)酵的目的;加入一定量的培養(yǎng)基,可及時起到稀釋作用,消除代謝產物的抑制作用,從而促進工程菌的生長繁殖。使用發(fā)酵罐發(fā)酵時,可以通過攪拌器和加大通氣量來保證細菌生長發(fā)酵所需的溶氧;發(fā)酵罐發(fā)酵采用流加式培養(yǎng),可控制流加的時機和模式等,更有效地保證了菌體生長繁殖過程中營養(yǎng)物質的及時補充以及代謝產物的流出與稀釋,促進了工程菌的高密度發(fā)酵。因此,可以預見:在優(yōu)化的條件下用發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體可使目的蛋白的表達量進一步提高。溶菌酶/超聲破碎細胞結合了酶法破碎細胞與機械破碎細胞的方法,既可徹底破碎細胞又可避免使用DNAaseⅠ,降低了成本,簡化了工藝,同時也減少了外源蛋白的引入。在洗滌包涵體時先后采用2mol·L-1尿素的緩沖液和2%DOC的緩沖液洗滌,低濃度的變性劑和離子型的去污劑的使用,洗除了大部分的雜蛋白(尤其是脂類和膜蛋白),提高了包涵