大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用

大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用

原始梢表達(dá)系統(tǒng)和真實(shí)梢表達(dá)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。前者是最早被采用,也是目前研究最清楚的表達(dá)系統(tǒng),其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是外源基因表達(dá)的首選。真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。因此,利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。在各種表達(dá)系統(tǒng)中,最早采用的是原核表達(dá)系統(tǒng),這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項(xiàng)技術(shù)主要是將已克隆入目的基因片斷的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌(一般是大腸桿菌),通過誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點(diǎn)是能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物,且所需的成本相對較低。大腸桿菌的遺傳背景清楚,又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特點(diǎn),成為外源基因的首選表達(dá)系統(tǒng)。1.1融合表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)的核心是表達(dá)載體。目前已知的大腸桿菌表達(dá)載體至少有以下幾種:非融合型表達(dá)、融合型表達(dá)、分泌型表達(dá)。若按啟動(dòng)子類型分,目前廣泛使用的大多數(shù)質(zhì)粒表達(dá)載體主要是由λ噬菌體的PL啟動(dòng)子、大腸桿菌乳糖操縱子的lac啟動(dòng)子、色氨酸操縱子的trp啟動(dòng)子,以及pBR322質(zhì)粒的β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子等一批強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)成的。非融合型表達(dá)優(yōu)點(diǎn)在于:表達(dá)的非融合蛋白與天然狀態(tài)下存在的蛋白在結(jié)構(gòu)、功能以及免疫原性等方面基本一致,從而可以進(jìn)行后續(xù)研究。為了提高翻譯效率,人們在設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí)采用了許多辦法:優(yōu)化翻譯起始區(qū)以達(dá)到高效表達(dá)、構(gòu)建一套SD-AUG間隔不等的表達(dá)載體cassette,以供選擇利用。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),使用“原核翻譯增強(qiáng)子”序列,以提高翻譯效率。鑒于野生型大腸桿菌基因多以多順反子形式來組織,故采用雙順反子表達(dá)載體來獲得目的基因的表達(dá);將“原核翻譯增強(qiáng)子”和雙順反子結(jié)合到一起,從而提高表達(dá)效率。融合表達(dá)載體通常SD-AUG已固定,翻譯起始信號組織合理,利于翻譯起始;簡化蛋白分離純化工藝;可增強(qiáng)mRNA及表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性;有些蛋白質(zhì)融合表達(dá)產(chǎn)生可溶性蛋白。目前成功的融合表達(dá)系統(tǒng)主要有:①GST系統(tǒng):融合蛋白通過谷胱甘肽——agarose進(jìn)行親和純化后,用凝血酶或Xa-因子切除融合蛋白的GST部分,獲得目的蛋白。但是并非所有GST融合蛋白都是可溶的。切割后目的蛋白N端一般殘留兩個(gè)氨基酸,且切割效率不高。②β-半乳糖苷酶系統(tǒng):通過藍(lán)白斑篩選得到目的克隆,融合蛋白用氨基苯硫代半乳糖苷酶(TPEG)——Sepharose進(jìn)行親和純化。③麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)系統(tǒng):某些目的蛋白與MBP融合后可分泌到外周質(zhì)中,通過直鏈淀粉交聯(lián)纖維素親和層析分離純化。④金黃色葡萄球菌蛋白A系統(tǒng):通過IgG——Sepharose親和層析分離純化,融合蛋白由HIV-1蛋白酶切割。陳燕等將胰島素原基因融合到金黃色葡萄球菌蛋白A的基因上,構(gòu)建成大腸桿菌的融合外分泌表達(dá)載體;結(jié)果高效分泌表達(dá),能方便地從培養(yǎng)基中分離得到具天然結(jié)構(gòu)的胰島素原。⑤純化標(biāo)簽融合:如FLAG-tag和His-tag,甚至將GST、His置于同一個(gè)表達(dá)載體中,進(jìn)行雙標(biāo)簽表達(dá),檢測、純化更容易。⑥其他融合系統(tǒng),如硫氧還原蛋白等。1.2蛋白質(zhì)分離和代謝真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式一般可分為3類:細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá),即以包涵體形式存在;細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá);蛋白分泌型表達(dá)。包涵體的形成是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最大的問題,它是細(xì)菌表達(dá)的蛋白在胞內(nèi)相互凝集而形成的無活性固體顆粒,具很強(qiáng)的折光性。包涵體的形成是由于肽鏈折疊過程中部分折疊的中間態(tài)之間的特異性錯(cuò)誤聚合,致不形成成熟的天然或完全解鏈的蛋白。包涵體雖然利于分離純化,但是對表達(dá)產(chǎn)物的活性不利。涉及包涵體形成的主要理化因素有:電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基的組分、半胱氨酸和脯氨酸的組分、親水性和氨基酸殘基的總數(shù)。為了克服包涵體的形成,常在表達(dá)外源基因的同時(shí),共表達(dá)分子伴侶和折疊酶。分子伴侶是細(xì)胞內(nèi)催化及維持其它蛋白質(zhì)正確構(gòu)象的一類蛋白質(zhì)分子,能識別、結(jié)合并穩(wěn)定部分折疊的蛋白中間體,避免不適當(dāng)?shù)姆肿娱g及分子內(nèi)作用;而它本身卻不是最終形成的功能蛋白質(zhì)的組成部分。大腸桿菌細(xì)胞中存在三種具有廣泛特異性的伴侶復(fù)合物:一是由10kD的GroES與60kD的GroEL兩種熱休克蛋白(Hsp)組成的GroES/EL;二是由DnaK(Hsp70)與DnaJ、GrpE組成的伴侶復(fù)合物,新生肽鏈通過與DnaJ作用被DnaK識別,再與GrpE結(jié)合;第三種是Cip系統(tǒng)(CipA與CipX),它的作用可能是識別易被降解的未折疊肽。折疊酶是指那些催化蛋白質(zhì)特定異構(gòu)反應(yīng)的酶,限制蛋白質(zhì)折疊的速率。大量表達(dá)這些酶可以促進(jìn)重組蛋白在大腸桿菌中的正確折疊。大腸桿菌中研究最多的折疊酶是二硫鍵異構(gòu)酶DsbA(disulfateBindingProteinA),其功能依賴于膜蛋白DsbB。共表達(dá)有兩種方法:一是采用雙順反子或多順反子系統(tǒng),將不同基因連同各自的SD序列串連在一起,克隆在同一啟動(dòng)子下游;或?qū)⒉煌瑏喕谋磉_(dá)單元,包括各自的啟動(dòng)子、SD序列和結(jié)構(gòu)基因串連起來。另一種方法是將不同基因克隆到兩個(gè)相容表達(dá)載體中,通過共轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)不同亞基在同一宿主中的共表達(dá)。Caspers等人將酪氨酸激酶Csk、Fyn或Lck等與DnaK、DnaJ、GroES等共表達(dá),得到了可溶蛋白。此外,還可通過改變發(fā)酵條件,如降低發(fā)酵溫度、加入不能代謝的糖、降低培養(yǎng)基的pH值等來改善蛋白的溶解性。蛋白分泌型表達(dá)又可根據(jù)表達(dá)場所的不同分為周質(zhì)分泌表達(dá)和胞外分泌表達(dá)。所謂周質(zhì)是指在大腸桿菌一類革蘭氏陰性細(xì)菌中,位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在大腸桿菌中,已成功使用了各種不同類型的信號肽,將細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì),如PhoA、OmpA、OmpT、LamB、β-內(nèi)酰胺酶、腸毒素ST-Ⅱ、LT-A、LT-B、金黃色葡萄球菌蛋白A、人生長激素信號肽等。氧化性的周質(zhì)間隙可以模擬真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境,便于新生肽鏈折疊成天然結(jié)構(gòu),獲得具完全生物活性的重組蛋白。一些可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中穩(wěn)定性提高。但周質(zhì)空間小,有時(shí)會(huì)發(fā)生二硫鍵的錯(cuò)配。胞外表達(dá)使重組蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化,便于大規(guī)模培養(yǎng)。目前使外源蛋白分泌到培養(yǎng)基的系統(tǒng)主要有α-溶血素(haemolysinA,HLyA)系統(tǒng)和大腸桿菌素釋放蛋白(bacteriocinreleaseprotein,BRP)系統(tǒng)。郭斯若等還報(bào)道了一種L-型細(xì)菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)。L-型細(xì)菌缺乏細(xì)胞壁,通過連接合適的信號肽,可以用于許多外源蛋白的可溶性、功能活性形式的分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中。1.3外源基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及基因表達(dá)效率主要影響因素有:密碼子的使用、增強(qiáng)子的使用、mRNA的穩(wěn)定性及翻譯起始效率、啟動(dòng)子的選擇、載體選擇、蛋白酶的影響等。原核生物中,由于不同tRNA含量上的差異產(chǎn)生了對密碼子的偏愛性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC8種密碼子是大腸桿菌的稀有密碼子。蛋白翻譯過程中,如果稀少密碼子連續(xù)出現(xiàn),會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成,發(fā)生密碼子錯(cuò)配。因此對含較高比例稀有密碼子的外源基因進(jìn)行表達(dá)時(shí),應(yīng)針對密碼子的偏愛性采取措施,如用非連續(xù)性多核苷酸定點(diǎn)突變方法對cDNA中稀有密碼子進(jìn)行同義突變,或提高某種氨基酸的tRNA濃度。GSrimivasan等報(bào)道Methanosarcinabarkeri甲胺轉(zhuǎn)甲基酶基因中UAG密碼子編碼了一個(gè)賴氨酸衍生物。故在重組蛋白表達(dá)時(shí)應(yīng)避免使用UAG作終止密碼子,防止轉(zhuǎn)錄過程的通讀。已知大腸桿菌格外偏愛終止密碼子UAA,尤其當(dāng)在其下游連上一個(gè)U而形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止的效率會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)。增強(qiáng)子是基因表達(dá)的重要調(diào)控元件,在原核細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)類似增強(qiáng)子序列,在一定程度上能提高大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)效率。羅文新等用T7啟動(dòng)子和Ω序列對PET24(+)載體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)行改造,并通過增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)來檢測表達(dá)效率,結(jié)構(gòu)表明Ω序列能顯著增強(qiáng)PET24(+)載體的表達(dá)效率。mRNA的穩(wěn)定性與外源蛋白的合成有很大關(guān)系,也是影響表達(dá)效率的重要因素之一。轉(zhuǎn)錄出的mRNA5′上游的SD序列與ATG間的堿基數(shù)和堿基組成對目的基因的翻譯效率很重要。有報(bào)道認(rèn)為,間距以6-11個(gè)堿基最好,堿基組成以C+G比例不超過50%為好。說明SD序列與ATG間的距離適當(dāng),能更有效地促進(jìn)翻譯的效率。一般認(rèn)為,降低翻譯起始區(qū)(TIR)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以提高mRNA的穩(wěn)定性,利于外源基因的表達(dá)。沈蕓等通過改變原有載體的TIR區(qū)的序列,成功構(gòu)建出了一個(gè)高效表達(dá)的載體。在大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)中,通過采用可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子,多數(shù)情況下真核基因可得到有效的轉(zhuǎn)錄。目前構(gòu)建的表達(dá)載體一般都采用較強(qiáng)且易于誘導(dǎo)的啟動(dòng)子,如PL、Lac、Tac和T7啟動(dòng)子等。由于大腸桿菌防御系統(tǒng)的自身保護(hù)作用,細(xì)胞內(nèi)的重組基因和蛋白可能會(huì)被其核酸酶和蛋白酶降解,這種降解作用具有一定的專一性和選擇性。因此,闡明大腸桿菌中核酸酶和蛋白酶的作用規(guī)律,對mRNA和基因產(chǎn)物采取一定的保護(hù)措施,可以使一些原先不能在原核生物中表達(dá)的真核基因獲得表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)了一些促進(jìn)mRNA穩(wěn)定性的序列,如ompA基因mRNA5′端非翻譯區(qū)末端的一段序列。有研究表明,大腸桿菌的重復(fù)性基因外回文序列能防止3′→5′外切酶的作用,進(jìn)而能穩(wěn)定mRNA并提高表達(dá)水平。另外,Invitrogen等公司都已經(jīng)開發(fā)出蛋白酶缺陷型菌株,以減少外源蛋白被降解的可能,從而提高重組蛋白的表達(dá)水平。2原核及真核系統(tǒng)的翻譯后的化學(xué)計(jì)量特征雖然原核表達(dá)技術(shù)已十分成熟,且能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物,但還存在許多難以克服的缺點(diǎn),如目的蛋白常以包涵體形式表達(dá),致使產(chǎn)物純化困難;原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善,表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低等。真核系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。因此,利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前,基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。2.1甲醇酵母蛋白質(zhì)的代謝主要包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等表達(dá)系統(tǒng)。其中甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng),也是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng),主要有H.polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三種,其中PichiaPastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、最廣泛。由于它具有無可匹敵的高表達(dá)特性,已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一。甲醇酵母的表達(dá)載體采用整合型質(zhì)粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關(guān)鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動(dòng)子(PAOX1)和轉(zhuǎn)錄終止子(3′AOX1)構(gòu)建成整合型表達(dá)載體。PAOX1是一個(gè)極強(qiáng)的啟動(dòng)子,醇氧化酶的產(chǎn)量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質(zhì)的30%,所以能使外源蛋白質(zhì)在它的控制下高效產(chǎn)生。其次,在載體中加入釀酒酵母的分泌信號和前導(dǎo)肽序列(α因子)構(gòu)建分泌型載體,一方面可以減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷,另一方面可以減少宿主細(xì)胞蛋白水解酶對外源蛋白質(zhì)的降解,pPIC9K,pMETαA、B、C均為此類載體。此外,還可使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體,形成多個(gè)表達(dá)單元,產(chǎn)生高產(chǎn)的菌株,此類載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時(shí),甲醇酵母中AOX1基因的表達(dá)受到抑制,而在以甲醇為唯一碳源時(shí),能誘導(dǎo)基因表達(dá),使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量更高。受體菌采用蛋白水解酶缺陷型,從而大大減少產(chǎn)物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。目前已有多種蛋白質(zhì)的基因在該表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)成功,包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等。有多種蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)生水平均為在細(xì)菌、昆蟲或哺乳動(dòng)物等表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)量的(10～100)倍。如表皮生長因子(EGF)在釀酒酵母中的產(chǎn)量為7.4mg/L,而在甲醇酵母中為450mg/L,提高了60倍。據(jù)報(bào)道,外源蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)量最高可達(dá)12g/L。國內(nèi)也有較多在甲醇酵母中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)成功的報(bào)道。相信隨著對甲醇酵母研究的進(jìn)一步深入,它在生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)方面將日益展示出誘人的前景。2.2外源基因調(diào)控蛋白表達(dá)的作用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能,如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等,使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白;其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%;可表達(dá)非常大的外源性基因(～200kD);具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力;對脊椎動(dòng)物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá)。在病毒感染晚期,由于大量外源蛋白的表達(dá)引起昆蟲細(xì)胞的裂解,胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)釋放出來,與目的蛋白混在一起,從而使蛋白的純化變得困難。另外水解酶的釋放會(huì)降解重組蛋白。為了克服以上這些困難,Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)主要包括三個(gè)調(diào)節(jié)外源蛋白表達(dá)序列:①絲蛾Bombyxmori的肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子;②B.mori的核型多角體病毒(BmNPV)的ie-1基因(編碼IE-1蛋白,作為轉(zhuǎn)錄激活因子,在體外激活肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子);③BmNPV的同源重復(fù)序列3(HR3,可作為肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)子)。三者協(xié)同作用,從而大大地提高外源蛋白的表達(dá)水平。另外,一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,該病毒由AcNPV及BmNPV發(fā)展而來。Lee等構(gòu)建了桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)能將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞,不會(huì)引起宿主細(xì)胞的裂解,且蛋白表達(dá)水平與鱗翅目細(xì)胞相似。因此,桿狀病毒-S2系統(tǒng)是一個(gè)很有應(yīng)用前景的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。張志芳等研究發(fā)明了一種利用昆蟲激素提高昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)效率的方法,包括應(yīng)用昆蟲蛻皮激素(MH)、昆蟲保幼激素(JH)及MH和JH的聯(lián)合使用以提高外源基因和多角體蛋白基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率,以及昆蟲桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中的復(fù)制效率。通過這種方法可以大大提高外源基因和多角體蛋白基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率,增加外源蛋白和多角體病毒粒子產(chǎn)量,節(jié)約生產(chǎn)成本。2.3誘導(dǎo)細(xì)胞外源基因表達(dá)由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì),在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的方法主要有:一是感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞,二是通過脂質(zhì)體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及DEAE-葡聚糖法等非病毒載體的方法。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí),一般不需要誘導(dǎo);但當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞有毒害時(shí)應(yīng)采取誘導(dǎo)。誘導(dǎo)型載體主要與啟動(dòng)子有關(guān),如熱休克蛋白啟動(dòng)子可在高溫下被誘導(dǎo)。朱曉東等構(gòu)建了由四環(huán)素調(diào)控的增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表達(dá)載體,結(jié)果利用四環(huán)素誘導(dǎo)可有效地提高外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。外源蛋白的表達(dá)有時(shí)會(huì)對哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響,導(dǎo)致外源基因不能穩(wěn)定表達(dá)。Mielke等構(gòu)建了一種能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)異二聚體蛋白的載體系統(tǒng),無序繁瑣的