植酸酶及其生產(chǎn)概述

植酸酶及其生產(chǎn)概述李大剛1張秉勝2張廣民1（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所哈爾濱1500302大連翔大科技股份有限公司116620）磷在畜禽營養(yǎng)中發(fā)揮著重要的作用，是機體重要的結(jié)構(gòu)成分，同時參與機體諸多重要的生理、生化過程。例如，在能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸和脂肪代謝、神經(jīng)組織代謝、骨骼生長以及脂肪和其他脂類運輸方面起著重要作用。因此，如果日糧中磷缺乏或不足，會引起生長緩慢或停滯，出現(xiàn)骨病，甚至死亡等嚴(yán)重后果。飼料原料中含有大量的磷，但一般谷物中60%以上的磷以植酸磷形式存在而不能為單胃動物所利用。而植酸酶是一類催化植酸（肌醇六磷酸酯）及植酸鹽水解成無機磷和肌醇的酶的總稱。植酸酶不但可以使單胃動物利用有機磷，還可減少磷的排出，減輕環(huán)境污染，所以植酸酶引起眾多科研工作者的廣泛關(guān)注。1植酸酶的應(yīng)用豬、禽等單胃動物飼料的主要原料是玉米、豆粕、糠麩、棉籽粕、菜籽粕等，它們所含的磷大部分以植酸磷形式存在，占總磷的60%?90%。但是單胃動物的飼料中，植酸具有強烈的抗?fàn)I養(yǎng)作用，其原因是：（1）單胃動物缺乏分解植酸的酶類，因而無法利用植酸中的磷。（2）由于植酸上的磷酸基團呈負電性，它與一些陽離子如Ca 2+、Mg2+、Zn 2+、Cu 2+、Mn 2+、Fe 2+和K+等有很強的螯合能力，形成不溶性鹽，從而影響畜禽對這些礦物元素的吸收和利用，因而降低了這些礦質(zhì)元素的生物效價。（3）植酸上的磷酸基團還可以與飼料中的蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉和脂質(zhì)等物質(zhì)上的陽離子基團結(jié)合，使其溶解性降低，從而影響畜禽對這些營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，降低蛋白質(zhì)的生物有效性。（4）植酸還可以與動物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，如淀粉酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶和酸性磷酸酶等結(jié)合，降低這些酶的活性，使整個日糧的養(yǎng)分利用率降低。（5）植酸對維生素也存在不利影響。因此動物采食高植酸含量的飼料后常表現(xiàn)厭食、消瘦、繁殖機能衰退等。表1某些飼料原料中磷的含量及利用率（NRC，1994）植酸酶用于飼料，可以提高飼料中植酸磷的利用率，減少磷的排放量，降低環(huán)境中磷的污染，并能解除植酸抗?fàn)I養(yǎng)作用，從而提高飼料消化利用率。表1列舉了幾種常用動物飼料原料中磷的存在形式和畜禽利用情況，從表中可以看出這些原料中磷的利用率比較低。如果植酸磷能夠被充分利用，則日糧中的磷含量已基本可滿足畜禽營養(yǎng)需要，可較少甚至不用再額外添加無機磷。2植酸酶的分子生物學(xué)特性植酸酶屬于磷酸單酯水解酶，是磷酶的一種特殊類型。植酸酶廣泛分布于自然界，存在于微生物、植物和動物的組織中 〔1〕。植酸酶在這些有機體中的作用不同，植物中的植酸酶在發(fā)芽過程中被誘導(dǎo)，為生長的幼苗提供磷和肌醇，后者是重要的生長因子 〔2〕；微生物中的植酸酶在有機體磷饑餓時被誘導(dǎo)表達，促使周圍植物來源的植酸釋放磷供給有機體利用〔3〕；動物細胞中植酸酶的功能現(xiàn)不詳?，F(xiàn)在許多植酸酶已被克隆，如來自真菌黑曲霉、細菌大腸桿菌、哺乳動物的植酸酶等。經(jīng)鑒定這些酶都是單體蛋白，分子量在40?100kDa之間，有廣泛的底物特異性，序列有很大的差異，但一般具有高度保守的RHGXRXP序列〔4〕怎么減肚子，C-末端His-Asp序列（HDmotif）等，參與催化反應(yīng)〔5〕。3影響植酸酶的因素口植酸酶的活性受許多因素影響，主要有pH、溫度、作用時間、抑制劑、激活劑及其自身來源等。3.1pH值、溫度對植酸酶活性的影響：植酸酶同其它酶一樣，也有酶作用的最適pH值和最適溫度，一般最適pH范圍為4.5?6.0，溫度最適范圍為45?60°C口口〔6〕□，當(dāng)超過最適范圍時，酶活性會迅速下降。3.2 影響植酸酶活性的因子：植酸酶活性受到許多金屬離子的影響，如「。口口2+口、ZM^2+口、Cu^^2+口、Cd^^2+口、入1口口3+口等多價離子可與酶底物植酸發(fā)生絡(luò)合作用，形成難溶的復(fù)合物，降低了植酸的有效濃度，從而反映出酶活性的減少口口〔7〕口。MarkusWyss等口口〔8〕□報道，磷酸、鉬酸鹽、氟化物、EDTA、和順N-乙基丁烯等也可不同程度的抑制酶活性。王紅寧等口口〔9〕□報道低磷狀態(tài)可明顯提高植酸酶的活性，而高磷則起抑制作用（當(dāng)磷濃度達1.0mM時，酶活性被完全抑制）。4植酸酶的催化機制根據(jù)大腸桿菌植酸酶催化機制，人們推測植酸酶的反應(yīng)機制為：（1）三肽RHG的精氨酸殘基，即胍基中的正電荷直接與底物植酸的磷酸基團相互作用，使其對親荷攻擊更敏感。（2）在共價連接的磷-組氨酸中間物中，組氨酸殘基作為親荷物質(zhì)。（3）C-末端序列HD的天門冬氨酸殘基提供質(zhì)子給底物，釋放磷。然而JanneKerovu?？诳凇?〕□等發(fā)現(xiàn)桿狀菌植酸酶的催化機制卻完全不同，它的穩(wěn)定性和活性依賴于CaM2+口離子。在酶中有6個CaE2+口離子毛孔大怎么辦，其中3個為高親和性，與酶的穩(wěn)定性有關(guān)，另3個低親和性的。3口口2+口離子調(diào)節(jié)酶的催化活性。植酸通過雙降解途徑產(chǎn)生三磷酸肌醇。途徑一：酶依次從3-位和1-位將磷酸鹽水解下來，將第一個磷水解后，酶與底物分離，然后底物再結(jié)合到酶的活性位點水解第二個磷，產(chǎn)生中間物2,4,5,6-四-磷酸肌醇，再將5-位磷水解下來，得到產(chǎn)物2,4,6-三-磷酸肌醇；途徑二：首先是依次將6-位和4-位的磷水解，得到的中間產(chǎn)物1,2,3,5-四-磷酸肌醇釋放后，再與酶結(jié)合，將2-位磷水解，得到終產(chǎn)物1,3,5-三-磷酸肌醇。5植酸酶的生產(chǎn)□近年來研究的主要思路集中在通過基因工程的手段克隆植酸酶基因，然后在生物反應(yīng)器中高效表達植酸酶基因以解決植酸酶在原始天然材料中含量太低而難以大量提取的問題。通過基因工程技術(shù)利用生物反應(yīng)器有望成百上千倍地提高它的表達量，或在分子水平上改造植酸酶基因，從而改變植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)如耐溫性、pH適性、催化活性等，提高其在飼料中使用的有效性。如：TomschyA等口口〔10)□對一系列真菌植酸酶序列的分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列只有49%?68%的同源性，并且催化特異性、底物特異性及最適范圍廣泛不同。因此，排毒養(yǎng)顏膠囊他們通過對非保守活性位點一些氨基酸殘基的突變來將酶的最佳特性合并到一株酶上；RodriguezE等口口〔11)□通過對大腸桿菌酸性磷酸酯酶基因appA突變，產(chǎn)生三株分別獲得4,2,4個潛在糖基化位點的突變體，其中突變體C200N/D207N/S211N的糖基化水平雖未升高，但其與野生型相比，獲得了更高的酶活性(P<0.01)；在pH3.5?5.5之間活性更高；酶的特異性升高54%。Lehmann等口口〔12，13)□對嗜常溫和耐高溫的真菌植酸酶序列進行比較，通過一系列氨基酸突變，最終獲得了一株能耐90.4°C的植酸酶，并且它的催化活性不變，然后將活性位點處的一部分氨基酸用黑曲霉NRRL3135植酸酶的相應(yīng)殘基替換，最后獲得了一株與原來的活性、底物特異性、pH范圍等完全不同的植酸酶。1995年VanGorcomd等將植酸酶基因phyA置于來源于A.niger的淀粉葡萄糖苷酶(AG)啟動子之下，信號肽序列分別用AG信號肽的18個氨基酸序列，AG信號肽的24個氨基酸序列及植酸酶原來的信號肽序列3種構(gòu)建，植酸酶基因重組到A.niger基因組中獲得陽性克隆子，在這3種構(gòu)建中其植酸酶在重組菌株中的表達量分別達到了1.1、10口5、口0.5乂口10口5、2.8x10^5U/ml，與天然產(chǎn)生菌株僅有不到100U/ml相比有了大幅度的提高。目前，這一