植物基因工程中的載體

植物基因工程中的改進(jìn)之載體朱祺琪社科10033100104077【摘要】 植物基因工程經(jīng)歷了二十多年的發(fā)展歷程，雖然取得了令世人矚目的成績，但仍有許多問題一直困擾著這個(gè)領(lǐng)域的研究者。本文從各種文獻(xiàn)中整理了國內(nèi)外在構(gòu)建植物表達(dá)載體方面的一些新進(jìn)展，這些策略的最終目的都是為了更好地增強(qiáng)外源基因的表達(dá)水平，提高生物工程體的安全性?！娟P(guān)鍵字】植物基因工程載體啟動子內(nèi)含子定位信號位置效應(yīng)【引言】近幾年來植物基因工程的研究進(jìn)展十分迅速。在植物抗病、抗蟲、抗除草劑和改變植物的某些成份方面都已得到不少轉(zhuǎn)基因植株，有的已經(jīng)建成了品系;為提高作物的產(chǎn)量、抗逆能力、改進(jìn)它們的品質(zhì)進(jìn)行快速、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)的良種選育提供了一條全新的誘人的途徑。植物基因工程經(jīng)歷了二十多年的發(fā)展歷程，雖然取得了令世人矚目的成績，但仍有許多問題一直困擾著這個(gè)領(lǐng)域的研究者。突出的問題表現(xiàn)在外源基因往往表達(dá)效率不高，難以得到理想的轉(zhuǎn)基因植物（作物），轉(zhuǎn)基因作物的安全性不好。這些問題不僅成為植物基因工程發(fā)展的限制因素，而且也是近幾年在西歐等國家對轉(zhuǎn)基因作物有較大爭議甚至產(chǎn)生排斥反應(yīng)的直接原因之一。如何提高載體的表達(dá)效率，最大程度上消除植物基因工程的非安全因素，已經(jīng)成為當(dāng)下一個(gè)值得深思的問題。【正文】一、 植物基因工程過程簡介基因工程簡單地說就是采用目前知道的新技術(shù)，在大分子（DNA分子）水平上將個(gè)別基因的分子基礎(chǔ)輸入到另一種生物的細(xì)胞以定向改變其遺傳特性。一般來講，基因工程的實(shí)現(xiàn)主要分為三個(gè)步驟：1）以人工方法在現(xiàn)有的生物中取得所需要的DNA片斷，利用mRNA復(fù)制所需的DNA，即人工合成基因。2）將人工合成的基因輸入到新細(xì)胞當(dāng)中去，并使其與新細(xì)胞中原有的DNA相組合，即DNA的重組。3）篩選和培養(yǎng)有外源基因的細(xì)胞或組織，使其產(chǎn)生正常健康的轉(zhuǎn)基因植物，通過有性繁殖將優(yōu)良性狀傳遞給下一代。實(shí)現(xiàn)以上三步需要進(jìn)行以下工作：1）尋找目標(biāo)基因。2）取得目標(biāo)基因。3）基因的載體問題。二、植物基因工程載體的種類1、 載體是指運(yùn)載外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)載工具。它同外源DNA在體外重組成DNA重組分子，在進(jìn)入受體后形成一個(gè)復(fù)制子，即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)自進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。因此，作為載體應(yīng)該具有以下幾個(gè)要求：①有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn)，最好是有許多種限制酶的切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)；②外源DNA插入后不影響載體在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，載體應(yīng)對受體細(xì)胞無害，以及載體能接納盡可能大的外源DNA片段；③有利于選擇的標(biāo)記基因，可以很方便地知道外源DNA已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出；④具有促進(jìn)外源DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)。2、 克隆載體及表達(dá)載體載體又可分成克隆載體和表達(dá)載體兩大類?？寺≥d體一般是原核細(xì)菌將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接，再導(dǎo)入原核細(xì)菌內(nèi)，質(zhì)粒會在原核細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制，形成大量的基因克隆。被克隆的基因不一定會表達(dá)，但一定被大量復(fù)制。而表達(dá)載體是一些用于工程生產(chǎn)的細(xì)菌，他們被導(dǎo)入目標(biāo)基因，這些目標(biāo)基因會在此類細(xì)菌中得到表達(dá)。生產(chǎn)出我們需要的產(chǎn)物，導(dǎo)入的基因是有克隆載體產(chǎn)出的。最常用的載體是Ti質(zhì)粒載體。質(zhì)粒是許多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的染色體外的遺傳因子,它是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小從1kb直到200kb以上。質(zhì)粒所帶的基因通常有利于宿主細(xì)胞。受體細(xì)胞由于質(zhì)粒的進(jìn)入而產(chǎn)生了新的表型。質(zhì)粒復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身染色體的同一組酶系。有些質(zhì)粒處于“嚴(yán)緊控制”之下，即它們的復(fù)制是同宿主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步的。因此在每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒只有一份拷貝，或最多只有幾份拷貝。這稱為“嚴(yán)緊型”質(zhì)?！鉚i質(zhì)粒侵染植物的農(nóng)桿菌帶有Ti質(zhì)粒，侵染植物后會產(chǎn)生冠癭瘤。Ti質(zhì)粒上有一段transferDNA,長為12-24kb，能轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中。但是Ti質(zhì)粒長約200-800kb，過于龐大，并且不能在大腸桿菌中復(fù)制。其中質(zhì)粒載體主要有：PBR322質(zhì)粒載體、pBR325質(zhì)粒載體、pUC質(zhì)粒載體以及穿梭質(zhì)粒載體。除此之外，常用的載體還有久噬菌體、單鏈?zhǔn)删w載體、柯斯質(zhì)粒、噬菌粒載體、酵母人工染色體載體（YAC）以及細(xì)菌人工染色體載體（BAC）。另外，日本科學(xué)家還利用高等植物葉綠體和細(xì)菌之間的類似性（據(jù)信，高等植物的葉綠體在幾個(gè)世紀(jì)以前還是無生命的細(xì)菌），發(fā)展了一種更理想的把外源DNA轉(zhuǎn)移到植物里去的運(yùn)載體。京都大學(xué)農(nóng)學(xué)系Oyama,K把一種雜合的穿梭型運(yùn)載體做了些改變。在基因轉(zhuǎn)入到花椰菜花葉病毒和根瘤農(nóng)桿菌（Agribacttumefaciens）Ti-質(zhì)粒這樣的侵染性因子上時(shí)，這些運(yùn)載體就繞過所遇到的疾病因子。三、植物基因工程表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化策略將特定的外源基因構(gòu)建在植物表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)入受體植物，并不是植物遺傳轉(zhuǎn)化的最終目的。理想的轉(zhuǎn)基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定時(shí)間內(nèi)高水平表達(dá)，產(chǎn)生人們期望的表型性狀。然而，近二十年的發(fā)展歷史卻表明，外源基因在受體植物內(nèi)往往會出現(xiàn)表達(dá)效率低、表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定甚至基因失活或沉默等不良現(xiàn)象，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物無法投入實(shí)際應(yīng)用。另外，轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題已在許多國家引起人們的關(guān)注，例如，轉(zhuǎn)基因有可能隨花粉擴(kuò)散，抗生素篩選標(biāo)記基因有可能使臨床上的某些抗生素失去作用等等。以上問題的出現(xiàn)使得植物基因工程這一高新技術(shù)正處于一種前所未有的困擾時(shí)期。針對這些問題，近幾年人們對植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了多方面的探索和改進(jìn)，植物表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化就是其中最重要的一項(xiàng)內(nèi)容。1、啟動子的選用和改造外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。由于啟動子在決定基因表達(dá)方面起關(guān)鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問題。目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動子是組成型啟動子，在這些組成型表達(dá)啟動子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會表達(dá)。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可減少對植物的不利影響，目前人們對特異表達(dá)啟動子的研究和應(yīng)用越來越重視。已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動子主要包括器官特異性啟動子和誘導(dǎo)特異性啟動子。這些特異性啟動子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，使用天然的啟動子往往不能取得令人滿意的結(jié)果，尤其是在進(jìn)行特異表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，表達(dá)水平大多不夠理想。對現(xiàn)有啟動子進(jìn)行改造，構(gòu)建復(fù)合式啟動子將是十分重要的途徑。2、 增強(qiáng)翻譯效率為了增強(qiáng)外源基因的翻譯效率，構(gòu)建載體時(shí)一般要對基因進(jìn)行修飾，主要考慮三方面內(nèi)容：添加5'-3'-非翻譯序列，優(yōu)化起始密碼周邊序列，對基因編碼區(qū)加以改造3、 消除位置效應(yīng)當(dāng)外源基因被移人受體植物中之后，它在不同的轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平往往有很大差異。這主要是由于外源基因在受體植物的基因組內(nèi)插入位點(diǎn)不同造成的。這就是所謂的〃位置效應(yīng)〃。為了消除位置效應(yīng)，使外源基因都能夠整合在植物基因組的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，在目前的表達(dá)載體構(gòu)建策略中通常會考慮到核基質(zhì)結(jié)合區(qū)以及定點(diǎn)整合技術(shù)的應(yīng)用。一種可行的途徑是采用定點(diǎn)整合技術(shù)，這一技術(shù)的主要原理是，當(dāng)轉(zhuǎn)化載體含有與寄主染色體同源的DNA片段時(shí)，外源基因可以通過同源重組定點(diǎn)整合于染色體的特定部位。實(shí)際操作時(shí)首先要分離染色體轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的DNA片段，然后構(gòu)建植物表達(dá)載體。在微生物的遺傳操作中，同源重組定點(diǎn)整合已成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，在動物中外源基因的定點(diǎn)整合已獲得成功，而在植物中除了葉綠體表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合以外，細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中還很少有成功的報(bào)道。4、 構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體為了克服細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常出現(xiàn)的外源基因表達(dá)效率低，位置效應(yīng)及由于核基因隨花粉擴(kuò)散而帶來的不安全性等問題，近幾年出現(xiàn)的一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)一葉綠體轉(zhuǎn)化，正以它的優(yōu)越性和發(fā)展前景日益為人們所認(rèn)識并受到重視。到目前為止，已在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等發(fā)表）5種植物中相繼實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化，使得這一轉(zhuǎn)化技術(shù)開始成為植物基因工程中新的生長點(diǎn)。5、 定位信號的應(yīng)用上述幾種載體優(yōu)化策略主要目的是提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，然而，高水平表達(dá)的外源蛋白能否在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在以及積累量的多少是植物遺傳轉(zhuǎn)化中需要考慮的另一重要問題。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，如果某些外源基因連接上適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘栃蛄?，使外源蛋白產(chǎn)生后定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定部位，例如：葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等，則可明顯提高外源蛋白的穩(wěn)定性和累積量。這是因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定區(qū)域?yàn)槟承┩庠吹鞍滋峁┝艘粋€(gè)相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有效防止了外源蛋白的降解。6、 內(nèi)含子在增強(qiáng)基因表達(dá)方面的應(yīng)用內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的作用最初是由 Callis等在轉(zhuǎn)基因玉米中發(fā)現(xiàn)的，玉米乙醇脫氫酶基因（Adhl）的第一個(gè)內(nèi)含子（intron1）對外源基因表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用，該基因的其他內(nèi)含子（例如intron8,intron9）也有一定的增強(qiáng)作用。后來，Vasil等也發(fā)現(xiàn)玉米的果糖合成酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子能使CAT表達(dá)水平提高10倍。水稻肌動蛋白基因的第三個(gè)內(nèi)含子也能使報(bào)道基因的表達(dá)水平提高2?6倍。至今對內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的機(jī)制不不清楚，但一般認(rèn)為可能是內(nèi)含子的存在增強(qiáng)了mRNA的加工效率和mRNA穩(wěn)定性。Tanaka等人的多項(xiàng)研究表明，內(nèi)含子對基因表達(dá)的增強(qiáng)作用主要發(fā)生在單子葉植物，在雙子葉植物中不明顯。7、多基因策略迄今為止，多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究都是將單一的外源基因轉(zhuǎn)