實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳

PAGEPAGE3實(shí)驗(yàn)二瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式電泳儀的方法；

（3）學(xué)習(xí)在含有甲醛的凝膠上進(jìn)行RNA電泳的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實(shí)驗(yàn)室中分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pH2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。三、試劑與器材（一）材料

電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等

（二）試劑

1、50×TAE(1000mL)：242gTris,57.1mL冰醋酸，18.6gEDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。

3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。

②形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。

③使樣品呈色，使加樣操作更方便。四、操作方法（一）常規(guī)的水平式瓊脂糖電泳

制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表：

瓊脂糖的含量（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb）

0.360-5

0.620-1

0.710-0.8

0.97-0.5

1.26-0.4

1.54-0.2

2.03-0.11．凝膠制備制備0.8%瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖加入20mL0.5×TBE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-60℃時(shí)，加入EB至終濃度0.5μg/mL。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。

注：膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至502.加樣取10μlDNA樣液與2μl上樣buffeer混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。

注：點(diǎn)樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點(diǎn)樣量）。

3．電泳：電泳接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負(fù)，電壓為1~5V/cm（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）,待溴酚蘭移動(dòng)到一定位置，停止電泳。注：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當(dāng)瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí)，停止電泳。

4．觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。注：EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，易揮發(fā)，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。簡(jiǎn)單處理方法為：加入大量的水進(jìn)行稀釋（達(dá)到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。

（2）由于EB會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準(zhǔn)確地測(cè)定DNA的分子量，應(yīng)該采用跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、思考題1、附上電泳結(jié)果的圖片并進(jìn)行正確的標(biāo)注（如下圖）