流加培養(yǎng)對小球藻生長的影響

流加培養(yǎng)對小球藻生長的影響

小球藻是綠藻門的一種細(xì)胞藻類。它含有許多營養(yǎng)成分，如糖、養(yǎng)分、脂肪酸等。具有多種保健和藥理作用。小球藻糖具有抗腫脹、抗毒、抗血郁、增強身體免疫功能等作用。通過處理和破壁處理后，小球藻可以直接生產(chǎn)小型浮藻片、小球藻?；蛐∏蛟迥z囊。它適用于預(yù)防和輔助治療高血壓、高血糖、動脈硬化、冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化、慢性潰瘍、免疫功能低等疾病。它也可以用來開發(fā)具有更高成本的精細(xì)化工產(chǎn)品和藥物產(chǎn)品，如生產(chǎn)綠葉、橘氨酸、油脂等。該藥物產(chǎn)品的提取可以提取到醫(yī)藥產(chǎn)品中。此外，小球藻也可以用于環(huán)保處理。與人形成一個循環(huán)系統(tǒng)。人們稱出的co可用于小球藻的生長，而從小球藻產(chǎn)生的o2可用于人體呼吸。小球藻在航空航天中具有重要的開發(fā)價值。要更好地利用小球藻,首先要獲得大量的小球藻藻體,本研究通過優(yōu)化小球藻培養(yǎng)條件來提高小球藻生物量,為其進一步的擴大培養(yǎng)提供依據(jù).1材料和方法1.1藻類和機器1.1.1藻類的來源小球藻(Chlorellaspp)藻種由煙臺大學(xué)海洋生化研究所提供.1.1.2儀器HZQ-QG振蕩箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠).1.2小球藻的生長1.2.3生物量的測定用血球計數(shù)板計數(shù).1.2.4實驗用培養(yǎng)基在f/2培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進行優(yōu)化.1.2.5土壤浸出液的制備首先取沒有施化肥或農(nóng)藥的土壤在三角瓶(1L)底部鋪上1cm厚的土層,隨后加入1L蒸餾水,高壓滅菌30min后,靜置24h,傾出上清液即可使用.1.2.6培養(yǎng)條件23℃,光強為4.5×103lx,轉(zhuǎn)速為140r/min下培養(yǎng)1.2.7正交試驗優(yōu)化小球藻培養(yǎng)鹽小球藻生長所需要的營養(yǎng)元素有15～20種,天然水體的大多數(shù)元素都能滿足它的需要,不會成為限制性因子.C、N、P是小球藻生長的主要營養(yǎng)元素.小球藻營光自養(yǎng)生長,可直接利用空氣中的CO2.CO2主要以HCO3-的形式被利用.因此HCO3-鹽可直接作為小球藻生長的碳源ue001.氮是生物最重要的營養(yǎng)成分,而硝酸鹽一直是培養(yǎng)小球藻的一種普通氮源.培養(yǎng)基的pH是影響藻類有關(guān)生長代謝等許多生理過程的另一重要因子.本實驗利用正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基中NaHCO3、NaNO3和KH2PO4的濃度及小球藻生長適宜的pH,采用L9(34)正交表進行四因素三水平正交實驗。如表1所示.2結(jié)果與討論2.1氮源和磷源水平對小球藻生長量的影響按表1設(shè)計的因素水平在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),結(jié)果如表2所示.由表2可知,第5組實驗小球藻長勢最好,且當(dāng)pH值在6～7之間時小球藻生長情況較好,pH值為5時,小球藻的生長明顯較差;當(dāng)碳酸氫鈉濃度小于0.10g/L時,小球藻生物量隨碳酸氫鈉濃度的增加而增加,但超過0.10g/L時,小球藻的生物量又隨之下降;隨著氮源水平的升高小球藻生長量逐步升高,說明氮源水平取得不夠,需作進一步實驗;小球藻生長量隨磷源水平的升高而逐步下降,說明磷源水平取得過高,應(yīng)取較低的水平繼續(xù)實驗.總之,通過分析可知,較好的水平組合為A2B2C3D1,比較四因素的極差R知,影響小球藻生長的因素的主次順序為A>C>D>B,說明pH值對它的影響最大,其次是氮源濃度.為了對氮源和磷源水平作進一步的探索,設(shè)計實驗如表3所示,結(jié)果見表4.由表4可知,小球藻的生物量隨NaNO3濃度的增加而下降,故培養(yǎng)基中NaNO3最適濃度為0.225g/L;小球藻的生物量隨KH2PO4濃度的減少而下降,故培養(yǎng)基中KH2PO4最適濃度為0.005g/L.小球藻能利用光合作用將二氧化碳、水和無機鹽轉(zhuǎn)化為有機物.二氧化碳主要以HCO3-形式被利用,pH是影響培養(yǎng)基中HCO3-在總?cè)芙鉅顟B(tài)的CO2所占比例的主要因素,此外,pH值也會影響光合作用,并影響培養(yǎng)基中藻細(xì)胞對離子的吸收和利用,以及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生.因此,pH是影響小球藻生長的重要因素,與正交試驗的結(jié)果相符.2.2維生素的添加量對小球藻生物量的影響維生素是最早發(fā)現(xiàn)的生長因子,它們在小球藻生長過程中所起的作用主要是作為酶的輔基或輔酶參與新陳代謝.在已優(yōu)化好營養(yǎng)鹽和pH值的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,設(shè)計單因素實驗考察維生素需求量.在配好的培養(yǎng)基中按體積分?jǐn)?shù)添加混合維生素量0.10%、0.13%、0.16%、0.20%,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),結(jié)果如圖1所示.由圖1可見,小球藻的生物量先是隨著維生素添加量的增加而增加,當(dāng)維生素添加量超過0.16%時,小球藻的生物量反而會下降,由此可知,培養(yǎng)基中維生素的添加量以0.13%～0.16%為宜.2.3光合對小球藻細(xì)胞生長的影響小球藻進行自養(yǎng)生長時會利用CO2放出O2,培養(yǎng)基中通入大量的無菌空氣既可為活細(xì)胞提供碳源,而且會把抑制藻細(xì)胞生長的O2排出,同時又有助于保持藻細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)并促進營養(yǎng)物質(zhì)運送到細(xì)胞表面.但通氣量過大可能會損傷或殺死一些敏感細(xì)胞,應(yīng)保持較小的通氣量,并且通氣管道和過濾器都需無菌.培養(yǎng)條件:500mL培養(yǎng)基中添加1.5×106/mL的藻種于4.5×103lx下培養(yǎng)14d,通氣量水平取為:0,0.5,1.0,1.5,2L/min,結(jié)果如圖2所示.從圖2可以看出,小球藻在通氣量為1.5mL/min時,生物量最大.當(dāng)光照到培養(yǎng)液表面時,藻體本身對光有遮擋作用,故入射光穿透培養(yǎng)液時存在著不斷衰減的現(xiàn)象,且隨著培養(yǎng)密度的增加,這種光衰減現(xiàn)象會不斷加重,因此增加通氣量會加強培養(yǎng)液的混合,使小球藻每一個細(xì)胞接受光照的機會均等.但過強的通氣使之對細(xì)胞的剪切力加大,反而不利于小球藻的生長.2.4光飽和效應(yīng)實驗對于營光合自養(yǎng)生活的小球藻而言,光是藻生長的重要限制因素.當(dāng)溫度和營養(yǎng)不限制其生長時,光就成為影響小球藻自養(yǎng)生長的主要因素,即藻的生物量是光照的函數(shù).一般情況下,在一定光照范圍內(nèi)藻的光合作用效率會隨光照度的增加而增加,但光照度達到一定值時,光合作用效率幾乎保持在一定水平,不再增加,這種現(xiàn)象稱為光飽和效應(yīng).如果光照度超過光飽和點一定限度后,藻的光合作用效率將會下降,導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢甚至死亡,即光抑制現(xiàn)象.在光飽和點以下的光照度是藻生長的一個限制性因子ue001.光強取2.0×103,3.3×103,4.5×103,5.5×103lx進行單因素實驗,結(jié)果如圖3所示.由圖3可看出,光強為4.5×103lx時小球藻生長最好.光合作用由光反應(yīng)和暗反應(yīng)兩個過程組成,當(dāng)暗反應(yīng)所需的中間產(chǎn)物不能從光反應(yīng)中得到充分滿足時,整個過程的速率完全取決于光反應(yīng)的速率,即隨著光強的增加光合作用加強,小球藻的生長較快;若光反應(yīng)形成了大量中間產(chǎn)物,而暗反應(yīng)速率已配合不上光反應(yīng)的速率,此時光合作用的整體速率將只取決于暗反應(yīng)的大小,同時由于光照強度太強,會導(dǎo)致光合色素的光氧化和細(xì)胞中的某些酶受到氧化傷害而使光合作用速率下降,因而存在一個適宜的光照強度.2.5尿素用量對小球藻生長的影響氮是生物最重要的營養(yǎng)成分,硝酸鹽一直是培養(yǎng)小球藻的一種普通氮源,但在實驗過程中發(fā)現(xiàn),由于硝酸鹽的消耗會使培養(yǎng)基的pH變化較大.有研究表明,在藻類的生長過程中消耗等量的氮,以尿素作氮源則比硝酸鹽產(chǎn)生出較多的生物量,并引起培養(yǎng)基較小的pH之變化,因此添加尿素作為有機氮源考查其對小球藻生長的影響.尿素濃度取為0,0.30,0.60,0.90g/L,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),結(jié)果如圖4所示.實驗發(fā)現(xiàn)尿素是一種很好的有機氮源,并且在小球藻的培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基中pH一直非常穩(wěn)定,當(dāng)尿素濃度為0.30g/L時小球藻生長最好,而濃度為0.90g/L時則明顯不如對照組長得好,說明氮源量如果太多反而會抑制小球藻的生長.2.6土壤浸出液對小球藻生長量的影響土壤浸出液往往含有一些含碳,氮,磷的有機物,無機鹽和微量元素。這些成分有可能成為小球藻生長所需要的營養(yǎng)成分.在將營養(yǎng)鹽及pH優(yōu)化好了的培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)分別為:0,0.2%,0.4%,0.6%的土壤浸出液,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),結(jié)果如圖5所示.由圖5可看出,添加土壤浸出液后,小球藻的生長量明顯高于未添加的,且添加量在0.4%為最好.3小球藻培養(yǎng)基的配方確定pH是影響小球藻生長的重要因素.光照強度和通氣量通過影響小球藻光合作用強度而影響小球藻的生長.小