熒光顯微鏡及激光掃描聚焦顯微鏡使用課件

實(shí)驗(yàn)七-1細(xì)胞熒光染色觀察與熒光顯微鏡的使用（示范：細(xì)胞形態(tài)觀察與暗視野顯微鏡的使用）實(shí)驗(yàn)七-1實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c教學(xué)要求掌握熒光顯微鏡的成像基本原理及其使用；掌握暗視野顯微鏡的成像基本原理及其使用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c教學(xué)要求掌握熒光顯微鏡的成像基本原理及其使用；熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。一、熒光顯微鏡的成像原理熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其基本原理是利用一定什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤畋３止逃械臒晒馓匦詿晒獠ㄩL＞激發(fā)波長熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質(zhì)熒光的性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高對細(xì)胞的刺激小能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途優(yōu)點(diǎn)：熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途熒光顯微鏡及激光掃描聚焦顯微鏡使用課件熒光素的特性熒光素的特性對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組分的定性、定位、半定量研究。作為生物大分子篩選與鑒定的標(biāo)記物。熒光顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組分的定性、定位、半定量研究。熒光顯微鏡技術(shù)在生熒光顯微鏡及激光掃描聚焦顯微鏡使用課件二、暗視野顯微鏡的成像原理通過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改變途徑，不直接進(jìn)入物鏡，而是傾斜地照射到樣品上，由樣品表面的繞射光線入射到物鏡內(nèi)，產(chǎn)生樣品的衍射圖象。二、暗視野顯微鏡的成像原理通過特殊的暗視野聚光器，使照明光線三、試劑與器材青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（HE染色）甲醇、1‰丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡三、試劑與器材青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟蛙血細(xì)胞染色觀察：取少許蛙血→常規(guī)血涂片→涼干→甲醇固定10min→1‰

丫啶橙染色5min→水洗→室溫干燥（濾紙擦干玻片底面）→熒光顯微鏡觀察（先低倍后高倍觀察）（可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細(xì)胞）取洋蔥→撕取一小片內(nèi)表皮→平面單層鋪展于玻片上→室溫涼干→1‰丫啶橙染色5min→水洗（用吸管，小心掉片）→室溫干燥（或用濾紙擦干）→熒光顯微鏡觀察暗視野顯微鏡觀察蛙血細(xì)胞（示范）觀察人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（HE染色）四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟蛙血細(xì)胞染色觀察：取少許蛙血→常規(guī)熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察激發(fā)光源，保護(hù)眼睛。暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。

五、注意事項(xiàng)熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。五、注意事項(xiàng)六、作業(yè)與思考題：描述在熒光顯微鏡下所觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。繪圖比較人正常肝組織細(xì)胞和脂肪肝組織細(xì)胞。六、作業(yè)與思考題：實(shí)驗(yàn)七-2

激光掃描共聚焦顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)七-2實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1.掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1.掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理及LaserScanningConfocalMicroscopeLaserScanningConfocalMicros普通熒光顯微鏡的不足使用熒光物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞中的特定成分或結(jié)構(gòu)，不僅圖像與對比度增強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61λ/NA）。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理普通熒光顯微鏡的不足一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理2.共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。2.共聚焦掃描顯微鏡的成像原理ConfocalPrincipleConfocalPrinciple熒光顯微鏡及激光掃描聚焦顯微鏡使用課件每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個光學(xué)橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計(jì)算機(jī)軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個光學(xué)橫短面總是觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光、近紅外）照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像輸出：實(shí)時觀測,數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察LSCM的基本特點(diǎn)觀察方式：以熒光為主LSCM的基本特點(diǎn)3.共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)（如受體、抗原、抗體、酶、細(xì)胞骨架蛋白等基因表達(dá)產(chǎn)物）、DNA、RNA等細(xì)胞膜流動性（熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)）細(xì)胞內(nèi)氧自由基活性細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化膜電位3.共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用熒光顯微鏡及激光掃描聚焦顯微鏡使用課件三、試劑與器材青蛙冷丙酮、DAPI、甘油/PBS封片劑、濾紙、吸管、載玻片、蓋玻片激光掃描共聚焦顯微鏡三、試劑與器材青蛙四、實(shí)驗(yàn)步驟取涂有細(xì)胞的載玻片（細(xì)胞涂在中間），冷丙酮40C固定10min;PBS漂洗2次，每次3min;滴加DAPI溶液100ul室溫孵育30min;PBS漂洗3次，每次5min;滴一小滴甘油/PBS封片劑(pH8.5，PBS:甘油=1:9