液相色譜分離的溶劑效應(yīng)

液相色譜分離的溶劑效應(yīng)"溶劑效應(yīng)”會(huì)致使哪些峰形異樣？如何幸免溶劑效應(yīng)？在HPLC分析中樣品溶劑的選擇和流動(dòng)相是如何的聯(lián)系？為何建議利用流動(dòng)相溶解樣品？。。。。。一系列的問(wèn)題都和樣品溶劑的選擇緊密相關(guān)，如何解決真正的溶劑效應(yīng)問(wèn)題，又如何分辨哪些是非溶劑效應(yīng)問(wèn)題，不同的問(wèn)題有不同的解決方式，有哪些先輩留下的實(shí)戰(zhàn)體會(huì)可供分享呢？一路來(lái)看看吧！什么是溶劑效應(yīng)？樣品溶液的溶劑強(qiáng)度強(qiáng)于流動(dòng)相溶劑強(qiáng)度時(shí)可能會(huì)造成的峰展寬、峰分叉現(xiàn)象。即色譜圖上較早洗脫的峰前沿或開(kāi)叉，與此同時(shí)較晚洗脫的峰那么較為正常的現(xiàn)象。例如樣品溶液的溶劑是100%乙腈（100%的強(qiáng)溶劑），而流動(dòng)相的組成那么較弱，18%的乙腈與72%的水。第一個(gè)峰是開(kāi)叉的，而且與第二個(gè)峰相較，明顯地變寬了。當(dāng)樣品溶液的溶劑變成流動(dòng)相時(shí)，所有的峰形都改善了，且變得尖銳。溶質(zhì)溶劑性質(zhì)對(duì)溶解度的影響溶質(zhì)A溶制B相互作用A在B中的溶解度A…AB??EA--B非極性非極性弱高非極性弱低極住非極性弱履低極住極性強(qiáng)強(qiáng)高可能發(fā)生溶劑效應(yīng)的情形:出峰時(shí)刻早；保留弱；進(jìn)樣量大。用流動(dòng)相溶解樣品能夠取得專門(mén)好的峰形當(dāng)溶解樣品的溶劑不同于流動(dòng)相時(shí)，樣品溶劑與流動(dòng)相發(fā)生混合，樣品溶劑被沖稀。若是進(jìn)樣溶劑之強(qiáng)度高于流動(dòng)相，樣品在剎時(shí)會(huì)表現(xiàn)為在較強(qiáng)溶劑中，并以較快速度通過(guò)色譜柱。表此刻色譜圖上確實(shí)是：色譜峰的保留時(shí)刻縮短。'當(dāng)進(jìn)樣溶劑與流動(dòng)相混合時(shí)，一部份分子會(huì)先與流動(dòng)相混合，致使這些分子通過(guò)色譜柱的速度發(fā)生轉(zhuǎn)變，使峰形扭曲，發(fā)生變形。洗脫較早的色譜峰峰變形要比洗脫晚的色譜峰嚴(yán)峻。解決進(jìn)樣溶劑問(wèn)題的關(guān)鍵是使進(jìn)樣體積足夠小，如此稀釋進(jìn)程會(huì)超級(jí)快；或利用比流動(dòng)相弱的溶劑溶解樣品。較弱的溶劑會(huì)使樣品在色譜柱上發(fā)生濃縮，在某些情形下，色譜峰會(huì)比利用較強(qiáng)溶劑時(shí)窄一些。因此，在通常情形下，若是溶解樣品的溶劑比流動(dòng)相強(qiáng)，進(jìn)樣體積應(yīng)不高于25mL。進(jìn)樣體積大小與進(jìn)樣溶劑與流動(dòng)相之間的不同大小有關(guān)。這一不同很容易憑體會(huì)取得：慢慢加大進(jìn)樣體積，直至發(fā)生峰變形現(xiàn)象。采納比發(fā)生峰變形時(shí)小一些的進(jìn)樣體積即可。問(wèn)題中發(fā)生的峰變形確實(shí)是因?yàn)槿芙鈽悠返娜軇┘状紡?qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于流動(dòng)相，因此取得了變形的、展寬的峰。若是利用水來(lái)溶解樣品，溶解樣品的溶劑弱于流動(dòng)相，峰形會(huì)得以改善。在離子對(duì)色譜中，咱們建議利用流動(dòng)相來(lái)溶解樣品，以最大程度地降低基線假峰的顯現(xiàn)。樣品溶劑別離為100%乙臘、流動(dòng)相時(shí)峰形分析上圖中，色譜圖上較早洗脫的峰扭曲變形或開(kāi)叉，與此同時(shí)較晚洗脫的峰那么較為尖銳與對(duì)稱，這些現(xiàn)象顯示一個(gè)比較特殊的起因——樣品溶液的溶劑極可能強(qiáng)于流動(dòng)相。此種強(qiáng)溶劑效應(yīng)的例子在左圖中可見(jiàn)。此處的樣品溶液的溶劑是100%乙腈（100%的強(qiáng)溶劑），而流動(dòng)相的組成那么較弱，18%的乙腈與72%的水。第一個(gè)峰是開(kāi)叉的，而且與第二個(gè)峰相較，明顯地變寬了。當(dāng)樣品溶液的溶劑變成流動(dòng)相時(shí)，所有的峰形都改善了，且變得尖銳。見(jiàn)右圖。什么緣故呢？這是因?yàn)楫?dāng)樣品進(jìn)樣時(shí)，有可能顯現(xiàn)峰展寬，最正確的樣品溶液組成和體積將會(huì)維持在10%乃至更低,在那個(gè)例子里，當(dāng)樣品溶劑與流動(dòng)相溶劑強(qiáng)度不同時(shí),換句話來(lái)講,也確實(shí)是樣品未用流動(dòng)相溶解，因此，有些樣品分子溶解在強(qiáng)溶劑中，并隨強(qiáng)溶劑流過(guò)柱子,而有些那么溶解在流動(dòng)相中，從而致使峰分叉.當(dāng)樣品與流動(dòng)相強(qiáng)度相差較小，進(jìn)樣阻礙也會(huì)小，第一個(gè)峰可能會(huì)寬于第二個(gè)峰,而當(dāng)這種展寬致使必要的分離度降低時(shí),如此情形應(yīng)引發(fā)注意，在左圖中,利用一根短柱，和5gL進(jìn)樣,這與最正確進(jìn)樣體積4gL相近,用了極性更強(qiáng)的溶劑致使分離度明顯的降低,從降到（如右圖，分離度為2或更大是評(píng)估一個(gè)完善方式的一個(gè)必要參數(shù)，也是天天方式的驗(yàn)證參數(shù)，只是一個(gè)大體的分離度，任何一個(gè)方式或一根柱子都必需知足那個(gè)條件，當(dāng)進(jìn)樣為一倍時(shí)，也確實(shí)是10gL時(shí)，分離度更一步降低，此方式就不行了。樣品溶劑選擇不妥的解決方式骯址柯pitii揉州丈1WJJ-?!!'■￡4￡畤于我，&比各場(chǎng)，低B她更有到卡群到對(duì)孫耳0法」n咎成的暮用好品誑州喬濟(jì)亍心打：貧交符由sa制走陣秘檢備流明枉!?.:：■-li.代和作均*品怵混作組企支化忌#本梧與F：?」*；」霸土底應(yīng)導(dǎo))/n.芝糧合世帥波動(dòng)相b,他拌企遣構(gòu)海好1A初和誠(chéng)初■相苗豪一走夏或出不為勺身.出不少或H性生世食卷波動(dòng)+n理血■.■：--■.?.?：_.m、』'l.i?:;--1111‘I.?:沌捫節(jié)/■-.-.$沌't%"亭 ：,1■■咬JH訖既行tt氣.怯凡卡甘川戴％.j-ft-itAA^i.-4.愚蝶噪童(nsi)苞蜀屈湛念不;t皇闕于據(jù)動(dòng)俺霹合均5］良15 電峭-二"盡我*音(丈蛇的)骯村相汗乾度應(yīng)中心域刑配.成?,瓦姑iu備溶1H亦檔宅檢查St離相的切成依哲W*相JL巾仆1處.枝度化萱折節(jié)奪新的派帝利洗司相事彼或?主上頂!擋乎哩—…一芒更氣里聲動(dòng)？」—一…「一 ￡樣品溶劑最好具有哪些特點(diǎn)比較好?筆酒純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱吊穩(wěn)由于高效液相靈檄度高，對(duì)疝部相消削的純度箜求也高*不純的溶劑會(huì)引恒基線不?穩(wěn)，或產(chǎn)生齊偽峰”)。(2)溶劑時(shí)于荷測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性，gpfe夠曲溶解能力溶劑要與檢測(cè)器匹配對(duì)于UVTis,所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒(méi)有吸收或I吸收很小化學(xué)穩(wěn)定性好不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑低粘度，沸點(diǎn)適中減小溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力，降低柱壓，利于提高柱致，常用的低粘度溶劑有內(nèi)-酮、乙醇、乙臘等；粘度過(guò)低I的溶劑也不宜采用，如戊烷、乙醒等，易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡,影響分離HPLC溶劑的要求溶劑的極性要與待測(cè)樣品相匹配，若是溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但阻礙純化分離，且會(huì)使柱子惡化。實(shí)戰(zhàn)問(wèn)答Q&A，絕對(duì)接地氣!里面的溶劑效應(yīng)是如何產(chǎn)生的，該如何幸免?如何判定分叉的峰是不是由溶劑效應(yīng)造成，第一確實(shí)是通過(guò)HPLC儀器比對(duì)一下兩個(gè)劈叉峰的紫外吸收波譜，看看他們是不是能完全一樣的pv特點(diǎn)吸收，第二將進(jìn)樣體積調(diào)劑到m看看，峰是不是好轉(zhuǎn)，若是知足上面兩個(gè)條件幾乎就能夠夠確信是100%的溶劑效應(yīng)。產(chǎn)生緣故1，樣品溶液的溶劑極可能強(qiáng)于流動(dòng)相。例如樣品溶液的溶劑是100%乙腈（100%的強(qiáng)溶劑），而流動(dòng)相的組成那么較弱，18%的乙腈與72%的水產(chǎn)生緣故2,確實(shí)是進(jìn)樣量比較大，產(chǎn)生緣故3,樣品的pH值與HPLC流動(dòng)相pH差異，比如酸性流動(dòng)相體系，樣品pH偏堿性（pH=10），這種情形下也很有可能發(fā)生其實(shí)上面三個(gè)緣故歸結(jié)起來(lái)確實(shí)是一個(gè)緣故，那確實(shí)是樣品的溶劑與流動(dòng)相存在一些不一樣，當(dāng)樣品進(jìn)入流動(dòng)相的時(shí)候，由于這種龐大的不同，一部份樣品溶解進(jìn)入了流動(dòng)相，一部份還留在進(jìn)樣的溶劑里面，因此在HPLC上顯現(xiàn)了保留的不同，因此要解決那個(gè)問(wèn)題的最正確方案確實(shí)是，利用流動(dòng)相的起始梯度溶解樣品，若是由于溶解度的問(wèn)題，不能不改用其余的溶劑，那就只能降低進(jìn)樣體積來(lái)解決，比如5pl，1pL。高效液相做專屬性實(shí)驗(yàn)時(shí)，溶劑峰和目標(biāo)峰出峰時(shí)刻一樣如何辦?分離的是氨基酸類物質(zhì)，不是離子型化合物，流動(dòng)相用的甲醇和水，也是用流動(dòng)相配的溶劑，可是比例有少量不同，單進(jìn)溶劑時(shí)確實(shí)有溶劑峰，用流動(dòng)相配的樣品能夠和溶劑峰分開(kāi)，我在做腸灌流實(shí)驗(yàn)，可是當(dāng)樣品進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)灌流后，進(jìn)樣后就分不開(kāi)了，我想把樣品的出峰時(shí)刻延長(zhǎng)一些，以為能分開(kāi)，可是不明白怎么調(diào)整，實(shí)在沒(méi)方法?；卮穑?jiǎn)栴}1：你用的稀釋劑是純的有機(jī)相嗎?稀釋劑中有機(jī)相的比例一樣盡可能與流動(dòng)相一致，以減小溶劑效應(yīng).若是改變稀釋劑仍不能改善，那么說(shuō)明你的色譜條件不適合,檢測(cè)組分在色譜柱中幾乎無(wú)保留.若是你的化合物是離子型的，一樣需要利用緩沖鹽,緩沖液pH值應(yīng)在化合物pKa值正負(fù)2之外，以增強(qiáng)組分在色譜系統(tǒng)中的保留.若是不是離子型化合物，那么減少有機(jī)相較例,以增加組分保留時(shí)刻，躲開(kāi)溶劑峰.問(wèn)題2：氨基酸類物質(zhì)是兩性化合物，出峰時(shí)刻跟pH值有專門(mén)大關(guān)系，樣品通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)后，pH值確信是發(fā)生了轉(zhuǎn)變的，樣品的預(yù)處置就很重要了（那個(gè)你要請(qǐng)教其他高人，我沒(méi)做過(guò)生物方面的藥物分析）。若是你只是想單獨(dú)延遲樣品出峰時(shí)刻，能夠試著減少有機(jī)相較例，看能不能達(dá)到成效，若是不行，可能仍是要用緩沖體系。醋酸曲安耐德用高效液相色譜測(cè)定，流動(dòng)相為甲醇-水（60:40），ODSC18柱，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，柱溫30度。以前樣品用甲醇溶解后直接進(jìn)樣，色譜峰各項(xiàng)參數(shù)正常。此刻用甲醇溶解后進(jìn)樣，色譜峰變寬，必需用流動(dòng)相溶解才能正常。儀器與色譜柱未改換，溶解樣品的甲醇換成默克色譜純甲醇也仍是如此！什么緣故？另外我需要測(cè)定的另一個(gè)中藥中黃苓苷也顯現(xiàn)了這種現(xiàn)象？我此刻該如何辦？解答：溶劑效應(yīng)是確信的。溶劑效應(yīng)的原理其實(shí)很簡(jiǎn)單：確實(shí)是溶質(zhì)的極性和流動(dòng)相的極性不匹配，致使溶質(zhì)被流動(dòng)相包裹或部份包裹，不能充分分散并充分與C18互換，因此才致使峰展寬。你的醋酸曲安耐德極性并非是很強(qiáng)。我?guī)湍悴榱怂膌ogP,沒(méi)查到，但依照我的體會(huì)，并依照其結(jié)構(gòu)式我可能推算了一下，應(yīng)該在2左右，應(yīng)該屬于中等偏弱極性的化合物（C26）。因此其在60：40如此含水流動(dòng)相匹配度確信不行。以前你做的沒(méi)有問(wèn)題，一個(gè)緣故是上面列位所說(shuō)的，溶解樣品的甲醇可能含水量略微高一些，比如大約含水2%（只是猜想哈），可能就可不能顯現(xiàn)溶劑效應(yīng)，而這次用的甲醇含水量很低。另一個(gè)可能的緣故我感覺(jué)可能是原先柱子相對(duì)照較新，用了一段時(shí)刻后，柱頭可能有塌陷，致使溶劑效應(yīng)加重（這種可能性更大一點(diǎn)）。這些都是猜想的，不然很難說(shuō)明以前專門(mén)好，此刻不行的緣故。無(wú)非確實(shí)是這兩條。至于黃苓苷，我也查了其結(jié)構(gòu)式，極性跟醋酸曲安耐德也差不多，能略微強(qiáng)一點(diǎn)。一樣的問(wèn)題。解決方法：你能夠嘗試用90：10的溶液溶解樣品再試一下，若是變好了，那就說(shuō)明溶劑效應(yīng)很明顯。只能改變?nèi)軇悠返娜軇┝耍瑳](méi)別的方法。關(guān)于排除溶劑效應(yīng)，在咱們利用的甲醇當(dāng)中，其實(shí)并非是單單甲醇，還有其他成份，只是這些個(gè)成份，在紫外下不干擾測(cè)定罷了做過(guò)度離的朋友都明白，不同廠家，不同批次間甲醇的洗脫能力，體會(huì)證明確實(shí)不盡相同的，專門(mén)是關(guān)于對(duì)極性條件相對(duì)苛刻的分離情形。因此，問(wèn)題可能在于甲醇上，有條件的話，是不是能夠測(cè)一下那個(gè)批次甲醇的水分呢。固然，溶劑效應(yīng)還有其他方面的阻礙，比如系統(tǒng)，色譜柱…今天我做葛根素的測(cè)定，葛根素是用30%乙醇溶解，流動(dòng)相是甲醇-水（25:75），半年前的色譜峰對(duì)稱系數(shù)為，此刻變成了，峰明顯變胖！什么緣故此刻只要不是用流動(dòng)相溶解，就會(huì)顯現(xiàn)峰變形的情形呢？與我的儀器是不是有關(guān)系，仍是溶劑（比如甲醇）有關(guān)呢？一、 葛根素和黃苓苷包括醋酸曲安耐德他們都是結(jié)構(gòu)超級(jí)相似的三個(gè)化合物，因此一個(gè)出問(wèn)題，所有的都會(huì)有相似的問(wèn)題的。我感覺(jué)問(wèn)題最大的可能仍是在色譜柱的柱頭。溶劑效應(yīng)現(xiàn)象，柱子越細(xì)，進(jìn)樣量越大，目標(biāo)化合物和流動(dòng)相極性匹配度不同越大，問(wèn)題越明顯。若是你用的是超高壓的話，會(huì)更明顯。我在做HPLC/MS/MS的時(shí)候，用的都是的柱子，大體上都要用流動(dòng)相來(lái)溶解樣品，不然絕大多數(shù)情形下都有溶劑效應(yīng)。你若是用超高壓HPLC這種溶解效應(yīng)會(huì)很顯著。這種問(wèn)題沒(méi)別的方法，只有改用流動(dòng)相溶解。二、 你上面提到的葛根素的測(cè)定要做一個(gè)對(duì)如實(shí)驗(yàn)：一個(gè)是純?nèi)軇┤芙獾模粋€(gè)是流動(dòng)相溶解的。若是二者有區(qū)別，那說(shuō)明是溶劑效應(yīng)問(wèn)題，建議先用異丙醇清洗系統(tǒng)，若是溶劑效應(yīng)還在，建議再換成20微升進(jìn)樣定量環(huán)，每次進(jìn)10微升。滿環(huán)進(jìn)樣仍是有很明顯的溶劑效應(yīng)，工程師也沒(méi)有跟好的方法。若是二者沒(méi)有區(qū)別，那就不是溶劑效應(yīng)問(wèn)題。你半年前做的好好的，不代表這根柱子此刻就必需必然得好