慶大霉素人工抗原的合成及抗血清的制備

慶大霉素人工抗原的合成及抗血清的制備

慶大霉素（gs）是由小單胞菌（m）生產(chǎn)的一套結(jié)構(gòu)相似的氨基糖苷類抗生素引起的。結(jié)構(gòu)上是由脫氧化合物胺、紫胺和3-甲基-4-甲基-戊糖胺引起的苷類。慶大霉素對革蘭氏陽性和陰性菌有極好的抑制作用,因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和獸藥領(lǐng)域。然而,慶大霉素對人類具有明顯的毒害作用,對腦神經(jīng)、聽覺以及腎臟的損害嚴(yán)重[2~3]。因此對動物源性食品中慶大霉素的殘留量的限制與檢測是非常必要的。針對慶大霉素在食品和疫苗中的殘留,許多國家和機構(gòu)都規(guī)定了明確的最大殘留量(MRLs)。中國慶大霉素在牛和豬的脂肪和肌肉里以及雞和火雞的可食組織中的最高殘留限量為100μg/kg,在牛奶中為200μg/kg,在牛和豬的肝臟和腎臟中分別為2mg/kg和5mg/kg,疫苗中慶大霉素殘留量應(yīng)不高于50ng/劑;JECFA(TheJointFAO/WHOExpertCommitteeonFoodAdditives)推薦使用的慶大霉素在動物性食品不同組織MRLs范圍為100~5000μg/kg;歐盟規(guī)定的動物性食品中慶大霉素MRLs范圍是100~1000μg/kg,牛奶中的MRLs為100μg/kg,肌肉、脂肪中的MRLs為50μg/kg。目前,慶大霉素的檢測方法主要有微生物法、儀器分析法和免疫分析法。儀器分析法主要有高效液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜法(MS)、氣相色譜法(GC)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等。微生物法實驗周期較長;儀器分析法結(jié)果精確,但樣品前處理過程繁瑣,對技術(shù)人員要求高,檢測設(shè)備也非常昂貴,因此檢測成本高,尤其不適合大批量樣品的篩選。免疫測定作為一種快速、特異和靈敏度較高的檢測技術(shù)正逐步被應(yīng)用于小分子藥物殘留的檢測,樣品前處理簡單,操作方便,亦適于現(xiàn)場檢測。2003年Loomnas等人首次采用新霉胺作為半抗原合成人工抗原,制備的多抗可同時檢測脫氧鏈霉素類的多種藥物,在奶樣中對慶大霉素的半數(shù)抑制濃度為9ng/mL;2004年VaelrieGuadin等驗證了用ELISA試劑盒檢測牛奶中慶大霉素殘留量結(jié)果的準(zhǔn)確性高,重復(fù)性好。慶大霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制,關(guān)鍵是制備出特異性強、效價高的針對慶大霉素的抗體。而慶大霉素的分子量為477.6,是小分子半抗原,不具有免疫原性,必須與大分子載體蛋白交聯(lián),才能刺激動物產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。本研究通過對慶大霉素半抗原的研究分析,設(shè)計人工抗原合成方案,用獲得的免疫原去刺激新西蘭大白兔,產(chǎn)生了能與慶大霉素特異性結(jié)合的多克隆抗體,并對此多克隆抗體進(jìn)行了初步評價,為慶大霉素ELISA試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1原材料1.1.1藥物、酶標(biāo)、生物技術(shù)服務(wù)慶大霉素,新霉素,鏈霉素,妥布霉素,卡那霉素,環(huán)丙沙星,恩諾沙星,磺胺二甲嘧啶,氯霉素,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA),均購自Sigma(中國)公司;聚苯乙烯酶標(biāo)板,購于上海Corning;酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG-HRP),顯色劑(四甲基聯(lián)苯胺溶液,H2O2底物溶液),購于北京天根生物技術(shù)有限公司;透析袋、丙烯酰胺、甘氨酸、三乙胺和偶聯(lián)劑1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)等,均購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。新西蘭大白兔,由浙江省杭州師范大學(xué)提供并負(fù)責(zé)飼養(yǎng)。1.1.2超純水及溶液ELSIA使用液:(1)磷酸鹽緩沖溶液(PBS),0.01mol/L,pH7.4:0.27gKH2PO4,1.42gNa2HPO4,8gNaCl,0.2gKCl,定容1L;(2)包被液(CBS),0.05mol/L,pH9.6:1.7gNa2CO3,2.8gNaHCO3,定容于1000mL超純水中,4℃冰箱保存;(3)封閉液:含5%BSA的PBS;(4)顯色劑:為TMB的磷酸-檸檬酸緩沖液;(5)終止液:2mol/L的H2SO4;(6)洗滌液(PBST):0.05%吐溫-20的PBS;SDS-PEAG用液:(1)10%過硫酸銨:1g過硫酸銨溶解于1mL水中,新鮮配置;(2)30%丙烯酰胺溶液:29g丙烯酰胺,1gN,N’-亞甲雙丙烯酰胺,定容100mL;(3)1.5mol/LTris-HCl(pH8.8);(4)1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)(5)2×SDS凝膠上樣緩沖液:100mmol/LTris-HCl(pH6.8),200mmol/LDTT現(xiàn)用現(xiàn)加,4%SDS,0.2%溴酚藍(lán),20%甘油;(6)染色液:甲醇90mL,水90mL,冰乙酸10mL,0.25g考馬斯亮藍(lán)R250;(7)脫色液:甲醇180mL,水180mL,冰乙酸20mL。1.1.3儀器和檢測儀器酶標(biāo)儀(Genios)、紫外分光光度計(ShimadzuUV-2501pc)、垂直電泳儀(Bio-rad)、恒溫培養(yǎng)箱、超純水系統(tǒng)(Millipore)、全自動滅菌鍋、凝膠成像分析系統(tǒng)(GeneGenius)、磁力攪拌器等。1.2方法1.2.1慶大霉素a液、bsa、ova的合成本實驗采用碳二亞胺(EDC)法,參考文獻(xiàn)方法[16~17]并改進(jìn),將GM分別與BSA偶聯(lián)成人工免疫原,與OVA偶聯(lián)成包被原。稱量慶大霉素20mg充分溶解于0.75mL雙蒸水中;稱量EDC31mg充分溶解于1.5mL雙蒸水中,將兩者混合,4℃下攪拌反應(yīng)1h,記為A液。稱量BSA、OVA各12mg,分別溶解于0.75mL的雙蒸水,記為B液。將A液緩慢地滴加入B液,避光,4℃下攪拌反應(yīng)7h。待上述反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中,用純水4℃下透析三天,每天換液二次。1.2.2人工抗癲癇藥的測定1.2.1.1.紫外掃描方法采用紫外光譜掃描法對GM-BSA人工抗原和GM-OVA包被原的峰產(chǎn)物進(jìn)行長波段掃描,并計算偶聯(lián)物中半抗原與載體蛋白的結(jié)合比。1.2.2.2聚氟凝膠電泳sds-pg的發(fā)現(xiàn)采用5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行SDS電泳,對GM人工抗原進(jìn)行鑒定。1.2.3不同免疫方式治療的血清學(xué)問題將合成好的GM-BSA用無菌生理鹽水稀釋到2mg/mL,加入等體積佐劑(第一次免疫用弗氏完全佐劑,加強免疫均用弗氏不完全佐劑)。完全乳化后,采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣靜脈多種注射方式,免疫3只體重為2.5~3kg的健康新西蘭大白兔。第四次加強免疫后一周,耳緣靜脈采血,血樣37℃靜置2h,離心,吸取上層析出的血清,一般免疫7~8次。在本研究中,嘗試了一種新的免疫方式,即在七免兔血清效價和半抑制濃度穩(wěn)定后,不采取沖擊免疫取全血,而是繼續(xù)加強免疫,每隔兩周取血5mL(經(jīng)離心后可得抗血清3mL左右),然后繼續(xù)加強免疫。如此延長動物的免疫期,每隔兩周取血一次,一年后終止免疫取全血,所獲得的抗血清將多于普通免疫方案獲得的抗血清量。1.2.4采用間接elisa法測定血清中的抗體價格1.2.4.抗體效價的測定對免疫的三只新西蘭大白兔(分別標(biāo)記為GM-1、GM-2、GM-3)免疫的各階段效價變化進(jìn)行測定,以GM-OVA作為包被原,用CBS稀釋至一定倍數(shù),在96孔板上每孔加100μL,37℃孵育2h。以PBST洗板1次。再用封閉液封閉,每孔加150μL,37℃孵育2h?？寡逵妹赶II稀釋至一定倍數(shù),37℃孵育1h,洗板3次。每孔加入100μL酶標(biāo)二抗(1:8000),37℃孵育30min,洗板3次。每孔加入TMB顯色液100μL,37℃孵育顯色15min后,每孔加2mol/L硫酸100μL終止反應(yīng),測定A450值。以同一稀釋倍數(shù)下抗血清與陰性血清A450差值大于0.8時血清的最大稀釋度定為抗體效價。對每次免疫后取得的血清進(jìn)行效價測定,目前測定到第十五次免疫,將每次抗血清的效價進(jìn)行統(tǒng)計列表,制成曲線圖,觀察效價變化趨勢。1.2.4.酶清3ga1,3,32e以GM-OVA稀釋5000作為包被原,在96孔板上每孔加100μL,37℃孵育2h。以PBST洗板1次。再用封閉液封閉,每孔加150μL,37℃孵育2h?？寡逑♂尡稊?shù)分別為2000倍、4000倍、8000倍、12000倍、16000倍、20000倍、24000倍、28000倍,37℃孵育1h,洗板3次。每孔加入100μL酶標(biāo)二抗(1:8000),37℃孵育30min,洗板3次。每孔加入TMB顯色液100μL,37℃孵育顯色15min后,每孔加2mol/L硫酸100μL終止反應(yīng),測定A450值。平行試驗兩組,計算標(biāo)準(zhǔn)差,繪制曲線圖,同一吸光值下抗血清稀釋倍數(shù)高者效價較高。1.2.5酶標(biāo)二抗原激活劑a550以GM-OVA作為包被原,用CBS稀釋至1:2500、1:5000、1:10000,在96孔板上每孔加100μL,37℃孵育2h。以PBST洗板1次。再用封閉液封閉,每孔加150μL,37℃孵育2h?？寡逑♂尡稊?shù)分別為5000倍,10000倍,20000倍,24000倍,37℃孵育1h,洗板3次。每孔加入100μL酶標(biāo)二抗(1:8000),37℃孵育30min,洗板3次。每孔加入TMB顯色液100μL,37℃孵育顯色15min后,每孔加2mol/L硫酸100μL終止反應(yīng),測定A450值。選取吸光值在1.2~2.0之間,且包被原稀釋倍數(shù)與抗血清稀釋倍數(shù)相近的抗原抗體稀釋倍數(shù)為最適工作濃度。1.2.6間接競爭法測定了血清中的抗逆性1.2.6.gm和抗血清試驗以GM-OVA稀釋2000倍作為包被原,在96孔板上每孔加100μL,37℃孵育2h,洗板1次。再用封閉液封閉,每孔加150μL,37℃孵育2h?？寡逑♂尡稊?shù)為4000倍,GM標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為7個質(zhì)量濃度,分別為0.3ng/mL、1.0ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、27ng/mL、81ng/mL、243ng/mL,設(shè)置對照孔質(zhì)量濃度為0μg/mL,每孔分別加入不同質(zhì)量濃度的GM和抗血清各100μL,37℃孵育1h,洗板3次。每孔加入50μLHRP-羊抗兔酶標(biāo)二抗(1:8000),37℃孵育1h,洗板3次。每孔加入TMB顯色液100μL,37℃孵育顯色15min后,每孔加2mol/L硫酸100μL終止反應(yīng),測定A450值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算半抑制率IC50,統(tǒng)計十五次免疫的IC50,繪制趨勢圖。1.2.6.gm和抗血清試驗以GM-OVA作為包被原,用CBS稀釋至1:5000,在96孔板上每孔加100μL,37℃孵育2h,洗板1次。再用封閉液封閉,每孔加150μL,37℃孵育2h?？寡逑♂尡稊?shù)為10000倍,GM標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為7個質(zhì)量濃度,分別為0.3ng/mL、1.0ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、27ng/mL、81ng/mL、243ng/mL,設(shè)置對照孔質(zhì)量濃度為0μg/mL,每孔分別加入不同質(zhì)量濃度的GM和抗血清各100μL,37℃孵育1h,洗板3次。每孔加入50μLHRP-羊抗兔酶標(biāo)二抗(1:8000),37℃孵育1h,洗板3次。每孔加入TMB顯色液100μL,37℃孵育顯色15min后,每孔加2mol/L硫酸100μL終止反應(yīng),測定A450值,用EXCEL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程,計算半抑制率IC50(半抑制率為50%時GM的質(zhì)量濃度,抑制率=I=(B0-B)/B0×100%),并以B/B0達(dá)到90%時的慶大霉素質(zhì)量濃度為本研究的最低檢測極限(LOD),即IC10。1.2.7糖苷類物質(zhì)及其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)反應(yīng)物計算采用間接競爭ELISA的方法,以梯度稀釋的鏈霉素等氨基糖苷類物質(zhì)及其他結(jié)構(gòu)類似物作為競爭反應(yīng)物,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算其反應(yīng)的IC50,計算公式如下:交叉反應(yīng)率(%)=IC50(GM)/IC50(競爭物)×1002結(jié)果與討論2.1gm-bsa偶聯(lián)物的紫外吸收特征紫外掃描結(jié)果如圖1,GM(0.6mg/mL)、BSA(0.625mg/mL)的特征峰分別出現(xiàn)在245.0nm和279.0nm,而偶聯(lián)物GM-BSA(3mg/mL)的特征峰為277nm,與GM、BSA紫外吸收特征具有明顯差異,說明GM成功地偶聯(lián)到載體蛋白上。同理可得,GM-OVA合成成功,掃面圖如圖2。經(jīng)計算GM和BSA、OVA的偶聯(lián)比分別為5.7:1和16.9:1。2.2gm與bsa成功銜接從圖3可知,GM-BSA條帶相對BSA條帶出現(xiàn)滯后現(xiàn)象,說明其相對分子量較BSA變大,由此推斷GM與BSA成功交聯(lián);從圖4可知,GM-OVA相對OVA滯后,說明其相對分子量較大,由此推斷GM與OVA成功交聯(lián),但顏色較淺,說明濃度較低。從電泳圖還可看到,出現(xiàn)了大分子量(大于116.2kDa)的條帶,說明載體蛋白發(fā)生了自偶聯(lián)現(xiàn)象。2.3血清效價和半抑制率本研究中,每只新西蘭大白兔每次采血獲得抗血清3mL/次,預(yù)計最終可獲得有效抗血清接近100mL(目前已獲得45mL),遠(yuǎn)多于普通免疫方案獲得的抗血清量25~35mL。由于GM-1在四免后異常死亡,故只統(tǒng)計GM-2與GM-3血清效價。兩只兔血清效價和半抑制濃度跟蹤結(jié)果如圖5所示。從三免到八免,抗血清效價逐漸升高,由1:2000到1:20000;從九免后,血清效價保持在1:20000左右。與此同時,對兩只兔子的血清半抑制率進(jìn)行測試,趨勢變化如圖6所示,在免疫期間內(nèi),半抑制濃度在逐漸降低,即靈敏度逐漸升高,GM-3和GM-2的半抑制濃度分別在八免后和九免后穩(wěn)定在3ng/mL左右。利用棋盤法測定出GM-3的抗血清純化抗體效價最高(1:22000),因此選定GM-3抗血清做進(jìn)一步的研究。2.4抗m抗和抗操作抗的最佳工作濃度的確定棋盤法試驗結(jié)果表明,包被原稀釋5000倍,抗體稀釋10000倍時為建立間接ELISA的最佳工作稀釋倍數(shù),具體結(jié)果如表1所示。2.5gm的標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)檢測,GM對2只免疫大白兔的抗血清均具有能特異性結(jié)合。以GM-3抗體與人工抗原的最佳工作濃度建立間接競爭ELISA法,對照孔的A450值為B0,濃度對應(yīng)的A450值為B,以GM濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),結(jié)合率(B/B0)為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。在0.3~243ng/mL范圍內(nèi),線性方程為y=-0.1009lnx+0.6093和R2=0.9845,半抑制率IC50=2.954ng/mL,IC10=0.056ng/mL。2.6交叉反應(yīng)和交叉反應(yīng)越大,抗體特異性越差特異性即抗體與結(jié)構(gòu)類似化合物的交叉反應(yīng)程度,交叉反應(yīng)越小,抗體特異性越高;反之,交叉反應(yīng)越大,抗體特異性越差。結(jié)果見表2,此抗體特異