纖維素酶的蛋白質(zhì)工程

纖維素酶的蛋白質(zhì)工程摘要：纖維素酶是能夠水解纖維素0-1,4-糖苷鍵的酶類。通過(guò)序列分析鑒定纖維素酶在82類糖苷水解酶家族中占13種，但傳統(tǒng)上它們被分為兩類，分別是內(nèi)切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶。這兩類纖維素酶均可降解液體纖維糊精和非晶狀纖維素，但是也有一些特別的例外，即只有外切葡萄糖苷酶可以有效地水解晶狀纖維素。定點(diǎn)突變已經(jīng)成為鑒定纖維素酶的主要方式，從催化劑的鑒定到確定粘合殘基，由于晶體學(xué)原因，酶-底物復(fù)合物被限制通過(guò)包括糖苷合成酶在內(nèi)的新的改良酶結(jié)構(gòu)。同時(shí)對(duì)于可溶性底物和底物類似物的研究已經(jīng)提供了豐富的信息，但對(duì)于天然底物的降解機(jī)制和晶體纖維素的研究，還有很大挑戰(zhàn)。關(guān)鍵詞：纖維素酶內(nèi)切葡萄糖苷酶外切葡萄糖苷酶蛋白質(zhì)工程定點(diǎn)突變結(jié)構(gòu)合成寡糖1.緒論纖維素酶是能夠水解纖維素0-1,4-糖苷鍵的酶類。在很多糖苷水解酶序列基礎(chǔ)家族中都能發(fā)現(xiàn)纖維素酶。傳統(tǒng)上纖維素酶被分解為兩個(gè)類群，分別是內(nèi)切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶，反映了兩個(gè)類群在水解晶狀纖維素的酶活不同。一般來(lái)講，外切葡萄糖苷酶比內(nèi)切葡萄糖苷酶能更有效地降解晶狀纖維素。纖維素酶被廣泛用于各種工業(yè)目的，因此除了研究纖維素酶的定點(diǎn)突變，主要的研究還包括纖維素酶的克隆和表達(dá)。纖維素酶的蛋白質(zhì)工程主要被作為研究催化機(jī)制的工具。這涵蓋了活性中央殘基的誘變潛能，它們的后續(xù)動(dòng)態(tài)分析，且多基于序列基礎(chǔ)家族類別中的不變殘基鑒定。無(wú)活性的變種常作為研究三維水平下蛋白質(zhì)—配體復(fù)合物的工具。這種三維復(fù)合體已經(jīng)被用于檢測(cè)糖苷水解酶的修改和利用。分析特定的底物決定子已經(jīng)使酶工程具有修改功能。近來(lái)，在合成酶體系又有了令人振奮的進(jìn)展，通過(guò)構(gòu)建無(wú)水解活性的糖苷水解酶突變型，被稱作糖苷合成酶。這類酶具有高效產(chǎn)生寡糖的潛能，不論是作為推動(dòng)酶學(xué)研究的工具還是具有潛在的療效。一些工業(yè)酶的性質(zhì)，例如洗滌劑和腐質(zhì)霉屬Cel45A的共溶性有所增強(qiáng)。當(dāng)我們關(guān)注一種底物時(shí)，其他一些重要因子：如與分解晶狀纖維素這一目標(biāo)有關(guān)的、修改這一特征和特定的工程學(xué)特征都會(huì)被關(guān)注到分解纖維素的酶系統(tǒng)中。雖然事實(shí)上一些序列基礎(chǔ)家族與內(nèi)切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶十分相近，但是這些強(qiáng)有力的修改都不算成功。在敏感的價(jià)格市場(chǎng)，尤其是在生物降解方面，當(dāng)前的挑戰(zhàn)是如何高效又廉價(jià)的分解大量的晶狀纖維素。當(dāng)然，在這一過(guò)程中我們也有一些小的成就。在描述大量的成功的生物工程實(shí)例之前，我們先總結(jié)一下作為底物的纖維素自身，纖維素酶的各個(gè)家族，它們的三維結(jié)構(gòu)以及催化機(jī)制。1.1.纖維素的結(jié)構(gòu)纖維素是由被0-1,4-糖苷鍵連接的葡萄糖殘基組成的復(fù)雜而獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。這種合成的線性聚合鏈有超過(guò)10000個(gè)葡萄糖殘基且是不溶的。那些單鏈并不是單獨(dú)存在的，實(shí)際上它們相互黏著并聯(lián)形成了晶狀微纖維。微纖維的大小和結(jié)晶度基于端點(diǎn)的不同而變化。并且，纖維素的純化和干燥等物理處理也會(huì)影響到結(jié)晶度和聚合程度。最終纖維素含有大量的結(jié)晶和部分非結(jié)晶區(qū)域，結(jié)晶度也不像微纖維那樣一致。只有那些特殊來(lái)源的纖維素，例如從藻類和細(xì)菌中提取的纖維素具有近乎完美的結(jié)晶度。它們經(jīng)常被作為底物模型來(lái)檢測(cè)各類可降解晶狀纖維素的纖維素酶。纖維素酶的序列家族：從序列到三維結(jié)構(gòu)基于氨基酸序列的相似性，糖苷水解酶被分為80多個(gè)家族。運(yùn)用序列基礎(chǔ)分類法，對(duì)于早期序列基礎(chǔ)比對(duì)的纖維素酶均可查找。并且隨著不斷的完善，現(xiàn)在可以涵蓋所有已知的糖苷水解酶家族。大量的纖維素酶基因都已經(jīng)被克隆。在(5,6,7,8,9,12,26,44,45,48)這十個(gè)序列家族中可以發(fā)現(xiàn)它們，纖維素酶類似物也被提議放入第61和第74家族。現(xiàn)在，大概有450種纖維素酶基因可以再公共數(shù)據(jù)庫(kù)中查到。對(duì)于5-9,12,45和48[8,9]家族的纖維素酶，它們的三維結(jié)構(gòu)都是可以查到的。盡管實(shí)際上它們都可以降解0-1,4-糖苷鍵，但是它們顯現(xiàn)在拓?fù)鋵W(xué)上卻結(jié)構(gòu)各異，從所有的0折疊蛋白質(zhì)、0/a-折疊桶蛋白質(zhì)到a-螺旋蛋白質(zhì)。在1990年，木霉屬的reeseiCel6A(CBHII)，作為第一個(gè)被刊發(fā)出三維結(jié)構(gòu)的纖維素酶。從此以后8個(gè)家族中20多種纖維素酶的三維結(jié)構(gòu)被列出。這其中有三個(gè)家族是外切葡萄糖苷酶的典型代表。一個(gè)值得注意的特點(diǎn)，不僅纖維素酶而且很多糖苷水解酶都有自身的調(diào)制性。蛋白質(zhì)很少作為單一催化區(qū)域?qū)嶓w，但卻可以作為一個(gè)或多個(gè)序列組件結(jié)構(gòu)來(lái)聯(lián)系一個(gè)或多個(gè)無(wú)催化性序列組件。無(wú)催化性序列組件經(jīng)常參與蛋白質(zhì)-碳水化合物和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的交互作用。所有的無(wú)催化性序列組件，包括碳水化合物粘合區(qū)域，都被劃歸入序列基礎(chǔ)家族。低溶解性的纖維素可以耐受水解作用：酶在降解晶狀物質(zhì)時(shí)，不僅必須要發(fā)揮水解作用，而且必須使單糖鏈上的氫鍵斷裂并使之遠(yuǎn)離晶體結(jié)構(gòu)且維持這一狀態(tài)，與此同時(shí)，還要完成多項(xiàng)酶解反應(yīng)。這些酶在這一進(jìn)程中有不同的形態(tài)。進(jìn)行性酶，例如外切葡萄糖苷酶，通過(guò)一個(gè)可以保留單糖鏈的附著通道并阻止它向纖維素晶體靠近來(lái)維持自身的酶結(jié)構(gòu)。類似的進(jìn)程反應(yīng)也許也可以通過(guò)結(jié)合附加的粘合區(qū)域靠近活化中心來(lái)達(dá)到，例如第九家族的E4酶就密切的伴隨有CBM3a區(qū)域。對(duì)于純粹的內(nèi)切酶，內(nèi)切可溶多糖鏈時(shí)，典型地作為開放底物粘合裂隙時(shí)，催化結(jié)構(gòu)有可能才建立。糖苷水解酶的催化機(jī)制糖苷水解酶通過(guò)酸堿催化作用來(lái)斷開糖苷鍵。催化作用可以通過(guò)異頭碳原子位構(gòu)型保留或者是構(gòu)型的轉(zhuǎn)化來(lái)完成。催化機(jī)制已經(jīng)很好的表現(xiàn)出來(lái)并且經(jīng)常被總結(jié)。自從這些酶的蛋白質(zhì)工程主要目標(biāo)之一催化機(jī)制已經(jīng)被闡明，我們就必須首先在更多的細(xì)節(jié)上關(guān)注兩個(gè)反應(yīng)機(jī)制。倒位是一個(gè)簡(jiǎn)單的移位反應(yīng)。催化酸能夠提供氫離子促使其基團(tuán)離開（糖苷羥基有較高的酸離解常數(shù)致使它難以離開基團(tuán)），同時(shí)催化堿需要一分子水來(lái)置異頭物中心換親核基團(tuán)。酸和堿通常距離7-13埃，來(lái)調(diào)節(jié)吡喃環(huán)下的親核水。在很多纖維素酶系統(tǒng)，催化堿的存在都是有爭(zhēng)議的。正如Koshland在1953年描述的那樣，共價(jià)糖基酶中間體形成后，便開始水解，通過(guò)羰基陽(yáng)碳離子類似物轉(zhuǎn)換來(lái)形成。這需要兩個(gè)殘基，一個(gè)酶親核基團(tuán)和一個(gè)被稱作布朗斯泰德酸的酸堿催化劑，先使離開基團(tuán)質(zhì)子化以協(xié)助離開，并發(fā)揮堿的作用；第二步將水親核基團(tuán)質(zhì)子化。截止現(xiàn)在我們研究的所有系統(tǒng)中，親核基團(tuán)和酸堿催化劑常距離5-6埃。有一點(diǎn)需要注解的是，通過(guò)定位蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)而確定酶促機(jī)制，每個(gè)家族的催化立體化學(xué)也得以保持。纖維素酶的工業(yè)應(yīng)用直到90年代纖維素酶才有重大工業(yè)價(jià)值。它們?cè)诩徔椆I(yè)上發(fā)揮了很大的商業(yè)作用，隨著生物磨光的發(fā)展和減少絨毛的需要，降低紡織物起球，進(jìn)入了石磨洗的代入。它們?cè)诩埡图垵{工藝中有很大的潛力。它們?cè)谙礈旃I(yè)發(fā)揮著不同的作用：它們移除松動(dòng)的絨毛來(lái)使褪色的衣服變的光亮，另外由于反射散射光而導(dǎo)致無(wú)光外觀。對(duì)于棉料衣物它們也能夠清洗。近30年來(lái)運(yùn)用纖維素酶來(lái)降解生物已經(jīng)擴(kuò)展到較大的應(yīng)用范圍。但是，由于纖維素酶的價(jià)格或者纖維素酶的效率較低，導(dǎo)致這類應(yīng)用在經(jīng)濟(jì)上沒(méi)能拓展開來(lái)。2.纖維素酶的蛋白質(zhì)工程下面詳細(xì)敘述一些家族的纖維素酶的蛋白質(zhì)工程的成功范例。2.1.第五家族纖維素酶第五家族包括纖維素酶、甘露聚糖酶、外切-0-葡聚糖酶等在內(nèi)的不同種類的水解糖苷酶。這一家族的所有纖維素酶都是內(nèi)切葡萄糖苷酶。這些酶都表現(xiàn)出了相同的折疊，且通過(guò)異頭碳原子位構(gòu)型保留來(lái)完成酶促反應(yīng)。最早的蛋白質(zhì)工程的成果是有密切聯(lián)系的纖維素酶如何展現(xiàn)出不同的狀態(tài)，例如最適酸堿度。在序列水平上，不同芽孢桿菌屬纖維素酶有60%是相同的。兩種纖維素酶的親交子代產(chǎn)生量的工程試驗(yàn)：一種堿性枯草桿菌屬N4纖維素酶（NK1）和另一種中性枯草芽抱桿菌纖維素酶（BSC）。通過(guò)定點(diǎn)突變進(jìn)行復(fù)雜的氨基酸交換，以BSC作為參照，對(duì)中性NK1的5區(qū)殘基進(jìn)行誘變。兩個(gè)氨基酸殘基，絲氨酸287和丙氨酸296，在堿性排列中對(duì)活性起到了重要作用。通過(guò)雙重變異，絲氨酸287變異為天冬酰胺、丙氨酸296變?yōu)榻z氨酸，這樣就使NK1的酸堿活性側(cè)面和BSC近乎一樣。另一方面，對(duì)于酸性排列，像上述兩個(gè)五區(qū)那樣的幾個(gè)氨基酸變異對(duì)其酸堿活性并無(wú)太大影響。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及其他一些內(nèi)切葡萄糖苷酶所提供的信息，說(shuō)明了上述兩個(gè)氨基酸底物通過(guò)氫鍵網(wǎng)的重排對(duì)底物粘合位點(diǎn)或催化位點(diǎn)產(chǎn)生了重大影響。菊歐文氏菌Cel5A系統(tǒng)是一個(gè)利用琥珀抑制系統(tǒng)來(lái)研究纖維素酶功能的優(yōu)秀范例。這一系統(tǒng)有七個(gè)對(duì)分解纖維素活酶活性有重大關(guān)系的保守殘基。這一系統(tǒng)含有從嗜熱厭氧梭菌、解纖維梭菌、芽抱桿菌屬agaradhaerens、E.chrysanthemi酶、和aThermobiCdafuscap-甘露聚糖酶在內(nèi)的第五家族酶的三維結(jié)構(gòu)都可以鑒定和分析催化殘基。2.2.第六家族纖維素酶T.reeseiCel6A是第一個(gè)測(cè)出三維結(jié)構(gòu)的纖維素酶。從1990年開始，已經(jīng)報(bào)道了從T.fusca中篩選的內(nèi)切葡萄糖苷酶Cel6A，還有從腐霉中篩選的外切葡萄糖苷酶Cel6A及內(nèi)切葡萄糖苷酶Cel6B。這些蛋白質(zhì)的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)式是以由七個(gè)平行條帶組成的P-折疊為中心的P/a-折疊。第六家族的酶通過(guò)異頭碳原子位構(gòu)型轉(zhuǎn)化來(lái)完成酶促反應(yīng)。盡管第六家族的酶已經(jīng)進(jìn)行了重要的蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)，但是通過(guò)比對(duì)結(jié)果，仍然是有密切練習(xí)系統(tǒng)的纖維素酶家族之一，使我們更難分析它的催化機(jī)理。由于潛在催化殘基的變化，這些年來(lái)這一目標(biāo)并沒(méi)有因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)中的錯(cuò)誤序列存在而有所進(jìn)展。這種鑒定甚至是以Koshland單一移位機(jī)制為基礎(chǔ)的酶促反應(yīng)的存在仍然是受爭(zhēng)議的。第六家族中第一個(gè)進(jìn)行分析的酶，仍然是研究這類酶的典型，用來(lái)分析纖維單胞菌屬fimi內(nèi)切葡萄糖苷酶中的潛在催化殘基。沃倫和他在溫哥華的團(tuán)隊(duì)以T.reeseiCel6A和T.fusca內(nèi)切葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)序列同源性為基礎(chǔ)來(lái)研究C.fimi纖維素酶的蛋白質(zhì)工程。通過(guò)定點(diǎn)突變，在C.fimiCel6A活性中心的四個(gè)保守的天冬氨酸系統(tǒng)的替換了丙氨酸和谷氨酸鹽。三維結(jié)構(gòu)完整性被進(jìn)一步用在圓環(huán)二色性和粘合纖維二糖粘合桶。一些合成底物被用來(lái)選擇不同的催化作用。酶的Michaelis-Menten參數(shù)已被用于2,4-二硝基甲苯纖維二糖糖苷和羧甲基纖維素鈉。對(duì)于野生型C.fimiCel6A的最適pH來(lái)說(shuō)，kcat取決于質(zhì)子化集團(tuán)和deprotonated基團(tuán)的活躍程度，和酸堿催化劑的活躍位點(diǎn)保持一致。最初鑒定的蛋白質(zhì)突變體表明了：對(duì)于C.fimiCel6A來(lái)說(shuō)，天冬氨酸252和天冬氨酸392分別是酸催化劑和堿催化劑。在酸催化反應(yīng)中天冬氨酸287可協(xié)助天冬氨酸252，而天冬氨酸216卻對(duì)催化反應(yīng)沒(méi)有太大作用。C.fimiCel6A的天冬氨酸252丙氨酸突變型的最適是pH僅僅依賴于酸催化基團(tuán)，且這一突變型僅僅在與DNP纖維二糖糖苷反應(yīng)時(shí)表現(xiàn)出較高的活性，這表明了Asp252是一種酸催化劑。這些結(jié)果表明C.fimiCel6A通過(guò)包括酸催化作用和堿催化作用在內(nèi)的典型換向機(jī)制來(lái)完成水解反應(yīng)，這一機(jī)制首先被Koshland提出。這一提案并沒(méi)有被廣泛接受，并且其他人也提出了不同的解釋和結(jié)果?？的螤柎髮W(xué)的大衛(wèi)威爾遜和它的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)對(duì)T.fusca內(nèi)切纖維素酶Cel6A研究很多年了。他們的工作主要集中在該酶的表面殘基如何影響酶對(duì)底物的專一性。低活性的結(jié)晶纖維素表明纖維素進(jìn)入活性位點(diǎn)的路徑可能是水解結(jié)晶纖維素的限速步。這也成為一個(gè)圓環(huán)假說(shuō)，在底物粘合中起到了重要作用。用定點(diǎn)突變技術(shù)共獲得了15個(gè)表面突變體和5個(gè)環(huán)突變體。一種精氨酸237丙氨酸突變體對(duì)羧甲基纖維素的活性有所提高，但對(duì)其他底物的活性均無(wú)提高。芳香殘基的突變關(guān)閉了活性位點(diǎn)從而降低了對(duì)一些底物的活性。這一結(jié)果解釋了一個(gè)纖維素酶突變和動(dòng)力學(xué)的基本問(wèn)題。這些突變體分別對(duì)液體纖維糊精、羧甲基纖維素和結(jié)晶纖維素進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。所有的突變體除了一種對(duì)羧甲基纖維素的活性提高了175%以外，其他的突變體均沒(méi)有提高酶的催化活性。后來(lái)從無(wú)催化殘基中獲取的資料：研究了14種第六家族Cel6A活性位點(diǎn)附近的保守殘基對(duì)催化反應(yīng)、底物專一性、持續(xù)合成能力和底物粘合親和性的影響。四種殘基的七種突變體對(duì)羧甲基纖維素的活性有所提升，七種賴氨酸259組氨酸創(chuàng)造了最高的催化活力。有意思的是，這些殘基的其他突變體對(duì)對(duì)羧甲基纖維素的活性反而下降了。只有賴氨酸259組氨酸突變酶對(duì)acid-swollen纖維素活性高于濾紙，表明這一突變體是水解晶狀纖維的限速步。所有的突變體都對(duì)纖維三糖和纖維四糖表現(xiàn)出較低的活性，但是有兩種突變體，在次位點(diǎn)比Cel6A在2,4-二硝基苯基-0-D-纖維二糖糖苷有更高的kcat/Km值。這些結(jié)果表明那些保守的無(wú)催化殘基也可能對(duì)T.fuscaCel6A的活性和專一性有影響。通過(guò)更多定點(diǎn)突變細(xì)節(jié)來(lái)研究?jī)?nèi)切葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)。四種T.fuscaCel6A的固定天冬氨酸殘基突變體對(duì)應(yīng)著C.fimiCel6A的突變殘基，并且突變基因可由鏈霉菌屬lividans提取。酶純化之后在三種纖維素底物上測(cè)其活力，并且獲得了2,4-二硝基苯基-0-D-纖維二糖糖苷上的資料。作用于phosphoricacid-swollen纖維素是為了用pH來(lái)篩選突變酶。每一種突變纖維素酶的粘合親和性都通過(guò)兩種熒光配體和纖維三糖來(lái)測(cè)定，并且圓環(huán)二色性光譜也有所記錄。這些結(jié)果表明天冬氨酸117和天冬氨酸156在C.fimiCel6A殘基中扮演著同樣的角色：天冬氨酸117是一種酸催化劑，天冬氨酸156提升了天冬氨酸117的pKa。天冬氨酸79對(duì)于C.fimiCel6A殘基沒(méi)有獨(dú)特的功能，但是在T.fuscaCel6A中，這種殘基卻可以提高天冬氨酸117的pKa并且有較高的催化活性。最初威爾遜團(tuán)隊(duì)根據(jù)T.fuscaCel6A的三維結(jié)構(gòu)和對(duì)C.fimiCel6A的研究提出了潛在催化位點(diǎn)的定向突變，但是這僅僅加劇了人們對(duì)于基礎(chǔ)催化殘基的爭(zhēng)論。T.fuscaCel6A的天冬氨酸265天冬酰胺突變體僅僅保留了野生型7%的催化活性，表明了這一殘基并不是這一系統(tǒng)的催化位點(diǎn)。對(duì)比一下更高活性的C.fimi同源酶。我們可以進(jìn)一步斷定，我們實(shí)驗(yàn)室那些為刊發(fā)的資料，第六家族不同酶的突變位點(diǎn)會(huì)向我們提供出不同的結(jié)論。這也許就反映了協(xié)助催化的可能性：一個(gè)可選擇位點(diǎn)在某些范圍內(nèi)可能會(huì)協(xié)助某一位點(diǎn)突變。據(jù)推測(cè)天冬氨酸175有可能是T.reeseiCel6A的位點(diǎn)。雖然發(fā)現(xiàn)天冬氨酸175丙氨酸突變體保留了20%的活性，但這一結(jié)果與從T.fusca、C.Cmi還有T.reesei自身獲得的第六家族酶并不一致。淀粉微球基團(tuán)也表明威爾遜首次提出的同等位點(diǎn)支持C.fimi的結(jié)果，天冬氨酸401,一種連接精氨酸353和賴氨酸395的鹽鍵,構(gòu)成了一個(gè)位點(diǎn)的特殊環(huán)境。通過(guò)研究一種Cel6A的三維結(jié)構(gòu)，他們總結(jié)出天冬氨酸401作為催化位點(diǎn)可以使活性中心的底物發(fā)生重排。有一點(diǎn)是非常明晰的，在催化位點(diǎn)的問(wèn)題解決之前，這一家族的纖維素酶我們還有很多工作要去做。晶體底物的活性工程在第六家族的外切葡萄糖苷酶作用于晶體底物時(shí)，我們比對(duì)它們的獨(dú)特性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了隧道包裹環(huán)，且這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被廣泛接受。它們有可能作用于一個(gè)單糖鏈并且在催化反應(yīng)中阻止它接近纖維素晶體。這就使持續(xù)水解底物可以進(jìn)行下去。通過(guò)C.fimiCel6B的一個(gè)表面環(huán)的定點(diǎn)缺失巧妙的驗(yàn)證了這些環(huán)的作用。這種酶C-羧基近端環(huán)的缺失是為了嘗試和模擬一種內(nèi)切葡萄糖苷酶的性質(zhì)。酶對(duì)于可溶性底物，例如羧甲基纖維素的活性提高了，同時(shí)在酶反應(yīng)過(guò)程中對(duì)流動(dòng)性底物的活性也提高了，這些結(jié)果提高了底物的內(nèi)在分裂。對(duì)于T.reeseiCel6A的研究已經(jīng)涵蓋到+4次位點(diǎn)中的天冬氨酸727位點(diǎn)對(duì)晶體纖維素的活性。這表明在水解晶狀纖維素隧道入口有較重要的芳香族疏水環(huán)境。最近康奈爾大學(xué)的研究小組又在報(bào)紙上發(fā)表了一些研究成果，他們用一種持續(xù)的纖維素酶T.fuscaCel6B，并且介紹了六種環(huán)涵蓋了活性位點(diǎn)的十五個(gè)定點(diǎn)突變體。他們總結(jié)出所有的突變體酶對(duì)濾紙都有較低的活性，并且對(duì)于細(xì)菌微晶纖維素和SC有較低的持續(xù)合成能力。所以他們提出Cel6B的持續(xù)合成能力是水解不溶性和晶狀纖維素的一個(gè)重要因子。第七家族纖維素酶第七家族的纖維素酶，正如之前所描述的那樣，通過(guò)構(gòu)型的保留來(lái)完成催化反應(yīng)。這一家族的很多內(nèi)切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)都已經(jīng)明晰。三維結(jié)構(gòu)是一個(gè)雙0-sandwich，與豆莢凝集素家族中例如伴刀豆球蛋白A和第十六家族的地衣多糖酶的三維構(gòu)象相似。內(nèi)切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶在結(jié)構(gòu)上的差異主要體現(xiàn)在底物粘合位旁環(huán)的長(zhǎng)度和性質(zhì)的不同。在外切葡萄糖苷酶中這些圓環(huán)是展開的并且展現(xiàn)出隧道包裹形式。不論是第七家族的內(nèi)切葡萄糖苷酶還是外切葡萄糖苷酶在活性中心都有一個(gè)“三位一體”的羧化物。通過(guò)研究這些殘基的突變體和他們的同配酰胺物發(fā)現(xiàn)，這些殘基，例如T.reeseiCel7A的活性中心是谷氨酸212-天冬氨酸214-谷氨酸217。那些從T.reesei中得到的突變體，酶通過(guò)超標(biāo)達(dá)來(lái)保證其受到最小可能的污染。這些所有因素，三點(diǎn)突變較大的降低了酶的催化活性，盡管它們?nèi)匀槐Ａ袅艘恍┗钚?。在微發(fā)色底物2-氯-4-硝基苯和B-乳糖苷，kcat值降低到1/2000，而活性則分別是野生型的1/85和1/370，但是km值卻基本上沒(méi)有變化。谷氨酸212谷氨酰胺和谷氨酸217谷氨酰胺突變體作用于不溶性的底物BMCC基本上沒(méi)有什么活性，但是天冬氨酸214天冬酰胺突變體卻仍有活性?，F(xiàn)在通過(guò)很多研究已經(jīng)弄明白兩種谷氨酸鹽分別是催化親核基團(tuán)和催化酸堿位點(diǎn)。通過(guò)協(xié)同突變和三維構(gòu)象，活性中心結(jié)構(gòu)的幾個(gè)突變最終形成了兩個(gè)突變株:谷氨酸212谷氨酰胺和天冬氨酸214天冬酰胺，通過(guò)X光晶體學(xué),T.reeseiCel7A谷氨酸212谷氨酰胺突變株結(jié)構(gòu)有復(fù)雜的天然物：纖維二糖。在配體缺失的情況下，天冬氨酸214天冬酰胺突變體的活性中心有一個(gè)與谷氨酸212緊密相連的鈣離子。但是谷氨酸212谷氨酰胺突變體卻沒(méi)有。這就支撐了在催化過(guò)程中谷氨酸212是帶電體的假說(shuō)。一種野生型T.reeseiCel7A結(jié)合有0-碘芐基-1-硫代-D-葡萄糖苷，纖維二糖與谷氨酸212谷氨酰胺的兩個(gè)產(chǎn)物位點(diǎn)相結(jié)合。然而，纖維二糖殘基和催化殘基中纖維二糖遠(yuǎn)離三聯(lián)體所形成的糖苷不同，糖苷與圓環(huán)有非常緊密的聯(lián)系，且這一圓環(huán)是活性位點(diǎn)外圍的組成部分。通過(guò)微淀粉球形成的突變體具有更高的溶解晶體結(jié)構(gòu)，顯示了一個(gè)纖維素鏈如何被底物粘合隧道所結(jié)合?；钚晕稽c(diǎn)突變體谷氨酸212谷氨酰胺和谷氨酸217谷氨酰胺是通過(guò)纖維寡糖結(jié)晶，并且顯示出葡萄糖的部分覆蓋次位點(diǎn):-7到+4。粘合方式與纖維素殘基產(chǎn)生過(guò)程相一致，并且支持了T.reeseiCel7A是從纖維素鏈末端切斷纖維二糖開始反應(yīng)的這一假說(shuō)。第七家族也含有內(nèi)切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶。并且在催化晶狀纖維素時(shí)有不同的催化活性，對(duì)于更難溶的底物，內(nèi)切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶有不同的活性，這也預(yù)示著酶上有更大數(shù)量的次位點(diǎn)。內(nèi)切葡萄糖苷酶大概只有4-5個(gè)次位點(diǎn)。為了提高H.insolens內(nèi)切葡萄糖苷酶Cel7B次位點(diǎn)的數(shù)量，構(gòu)建了一個(gè)雙突變株來(lái)模擬與之相對(duì)應(yīng)的第七家族外切葡萄糖苷酶的次位點(diǎn)結(jié)構(gòu)。獲得了雙突變株的三維晶體結(jié)構(gòu)，并且雙突變株色氨酸確實(shí)和在T.reeseiCel7A中發(fā)現(xiàn)的展開次位點(diǎn)在相同的位點(diǎn)。動(dòng)力學(xué)測(cè)定表明，作用于可溶性微淀粉糊精時(shí)，H.insolensCel7B絲氨酸37色氨酸和脯氨酸39色氨酸突變體與Cel7B有大致相同的活性。phosphoricacidswollen纖維素時(shí)，有一個(gè)較小但卻意義重大的變化，km值的降低說(shuō)明了雙突變體對(duì)于較長(zhǎng)的多聚體底物確實(shí)有更好的粘合性。近來(lái)最令人振奮的是糖苷合成酶的構(gòu)建：糖苷水解酶在寡糖合成上的突變體。通過(guò)第七家族H.insolens內(nèi)切葡萄糖苷酶突變發(fā)展了一種更加強(qiáng)大的合成工具。這將被用在下面更過(guò)的細(xì)節(jié)中。第八家族纖維素酶第八家族酶是在異頭碳原子位通過(guò)構(gòu)型的轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行催化反應(yīng)。它的酶分子三維構(gòu)象是一個(gè)(a/a)6折疊桶。它的活性位點(diǎn)裂隙體系結(jié)構(gòu)給至少五個(gè)葡萄糖粘合次位點(diǎn)提供了空間。Ozaki等用芽抱桿菌屬KSM-330纖維素酶第一次鑒定了第八家族的催化殘基。C.thermocellumCel8A的結(jié)構(gòu)隨后也被鑒定，且同源的谷氨酸95可以很容易的被鑒定出來(lái)。但是，研究者提出了問(wèn)題，它們指定天冬氨酸152作為催化劑，由于天冬氨酸278也有這種可能性。第九家族纖維素酶第九家族酶通過(guò)異頭碳原子位構(gòu)型的轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行催化反應(yīng)。這是纖維素酶中最重要的家族，因?yàn)槠駷橹顾幸阎闹参锢w維素酶都是屬于這一家族的。該家族酶分子三維構(gòu)象是一個(gè)(a/a折疊桶。一些結(jié)構(gòu)顯示出與免疫球蛋白類似物有較為密切的聯(lián)系，例如C.thermocellumCel9A。有一些結(jié)構(gòu)作為連接T.fusca內(nèi)切葡萄糖苷酶Cel9A顯示出與第三家族的CBM有緊密的聯(lián)系。梭菌屬stercorariumCelZ位于蛋白質(zhì)的氨基末端的可能催化殘基是天冬氨酸84和谷氨酸447通過(guò)定點(diǎn)突變被替換掉。最小量的CelZ催化劑是由催化域和比鄰纖維素粘合域組成，lllc域C'家族被作為突變的靶位點(diǎn)。六個(gè)突變株酶和CelZC'蛋白質(zhì)通過(guò)熱穩(wěn)定性和活性、底物專一性、產(chǎn)量和協(xié)同作用等方面進(jìn)行比對(duì)。任何一個(gè)催化殘基的改變都使CelZ分解微晶纖維素的能力完全消失，然而堿催化劑天冬氨酸84卻在水解羧甲基纖維素時(shí)確保有內(nèi)活性。這也許反映了催化劑通過(guò)羧化物來(lái)水解羧甲基纖維素。內(nèi)活性C.stercorariumCelZ突變株在與不溶性纖維素反應(yīng)時(shí)表現(xiàn)出部分活性缺失，且被用于和C.ster-corarium外葡聚糖CelY酶的協(xié)同研究。正如期望的那樣，發(fā)現(xiàn)了依賴于CelZ外活性的協(xié)同現(xiàn)象。突變株天冬氨酸84甘氨酸和天冬氨酸84谷氨酸可以顯著的增強(qiáng)水解晶狀纖維素的能力，盡管我們從單個(gè)突變體的作用中并未發(fā)現(xiàn)任何被釋放出來(lái)的產(chǎn)物。第四十五家族纖維素酶四十五家族纖維素酶在異頭碳原子位通過(guò)構(gòu)型的轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行催化反應(yīng)。H.insolensCel45A原株的構(gòu)型在1993年被測(cè)出，不久之后，一種含有低聚糖的無(wú)活性差異突變體天冬氨酸10天冬酰胺的結(jié)構(gòu)也被測(cè)出。通過(guò)三維結(jié)構(gòu)、原株、伴有纖維二糖和無(wú)浸透活性纖維六糖的野生型，向我們說(shuō)明了它的結(jié)構(gòu)是一個(gè)伴有長(zhǎng)的互連環(huán)的06折疊桶。酶的表面有一個(gè)40埃的凹槽，催化殘基天冬氨酸10和酸催化劑天冬氨酸121都在這個(gè)凹槽上。一個(gè)寡糖聚合物顯示出在一個(gè)簡(jiǎn)單的移位、換向和反應(yīng)機(jī)制中，溶劑水也參與了反應(yīng)。一個(gè)大的構(gòu)象改變替代了底物粘合。這種“輕蓋子”提高了催化質(zhì)子引入的疏水環(huán)境，是裂縫點(diǎn)的催化位點(diǎn)放入，并且在底物近似物中形成了第三種天冬氨酸突變物。催化殘基的定點(diǎn)突變被用于判定酶的催化活性。這一家族的很多內(nèi)切葡萄糖苷酶作用于無(wú)定性纖維素時(shí)都比羧甲基纖維素時(shí)有更高的活性，但卻不能降解纖維素的結(jié)晶區(qū)。并且在底物粘合槽上進(jìn)行的殘基突變是在粘合點(diǎn)+1酪氨酸位點(diǎn)上完成的。這個(gè)氨基酸被其他十三個(gè)氨基酸替換，且動(dòng)力學(xué)資料顯示這一位置有一芳香族氨基酸是十分重要的。H.insolensCel45A已經(jīng)被用于蛋白質(zhì)工程改造以便提升其在工業(yè)領(lǐng)域與去污劑的共存性。Cel45A在一種常用洗滌劑C12-LAS中會(huì)失活。這是一種陰離子表面活化劑，解決酶活降低的方法是通過(guò)去除陽(yáng)離子氨基酸或者引入陰離子。另外一種方法是通過(guò)改變底物粘合凹槽從而阻止LAS進(jìn)入活性位點(diǎn)。總共有十六個(gè)位點(diǎn)被單獨(dú)或者聯(lián)合改變。這些變株被用于解開胍鹽氯化物變性劑和陰離子折疊劑C12-LAS的折疊。盡管通過(guò)離子平衡狀態(tài)下的簡(jiǎn)單二態(tài)模型發(fā)現(xiàn)Cel45A在胍鹽氯化物變性劑中是伸展的，但是在重折疊過(guò)程中卻有少量的中間產(chǎn)物的積累。七個(gè)二硫化物粘合并未測(cè)出在自然狀態(tài)下的穩(wěn)定性。Cel45A在C12-LAS低濃聚物中是展開的。通過(guò)分析16種Cel45A突變株，結(jié)果表明變性劑的展開狀態(tài)與洗滌劑只有很微弱地聯(lián)系。突變株與胍鹽氯化物變性劑在折疊性上有很大的相似性：在C12-LAS的伸展態(tài)中大概有多于1000個(gè)折疊。資料支持了一個(gè)洗滌劑展開的簡(jiǎn)單模型，通過(guò)引入正電荷或者去除負(fù)電荷從而大大提升了酶對(duì)洗滌劑的敏感度。然而和疏水洗滌劑末端的相互作用促成了一個(gè)較小的延伸。這暗示著由三維結(jié)構(gòu)中個(gè)別殘基決定的不同洗滌劑介導(dǎo)的展開路徑存在。雙突變循環(huán)表明以胍鹽氯化物變性劑的變性作用為測(cè)量基準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)近端殘基的突變比獨(dú)立突變所引起的斥力和去穩(wěn)定作用比獨(dú)立突變之和還要大，但酶C12-LAS親和力也降低了，因而總體來(lái)說(shuō)還是真正提高了酶在C12-LAS