檢測(cè)口蹄疫血清抗體的方法

檢測(cè)口蹄疫血清抗體的方法（一口蹄疫正向間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（間接血凝試驗(yàn)）該試驗(yàn)是以口蹄疫OACAsia-1型病毒和豬水泡病病毒的細(xì)胞培養(yǎng)（細(xì)胞毒經(jīng)PEG濃縮蔗糖密度梯度超離后純化的病毒抗原分別致敏戊二醛鞣酸處理的綿羊紅細(xì)胞而制成的血凝抗原用于快速檢測(cè)動(dòng)物血清中的口蹄疫和豬水泡病特異抗體水平。該法簡(jiǎn)易、快速、特異、直觀、是當(dāng)前測(cè)抗的實(shí)用方法。1．試驗(yàn)材料 V型96孔110。醫(yī)用血凝滴定板?。?0~100微升1升5升度徑5度0（0、疫OAC1、D。2法的。（1）疫苗接種動(dòng)物抗體水平監(jiān)測(cè)方法接種何種疫苗就使用何種正向血凝診斷液。①稀釋待檢血清在血凝板上18各液0微，待血清50微升入第1孔混后中出50微升加第2孔勻從取出50微升加入第3孔……直至第8孔混勻后從該孔取出50微升丟棄，保持每孔50微升時(shí)1~8為12141816121：4、1：8、1：6。②稀釋陰性對(duì)照血清取中試管1支加稀釋液1.5毫升，再加陰性血清0.1毫升，充分搖勻陰性血清的稀釋度即為1：1。③稀釋陽(yáng)性對(duì)照血清取中試管5支，第1管液31毫第2~5管分液0.5毫升清0.1毫升加第1管中出05毫第2管出0.5毫升加入第3管……直至第5管此時(shí)各管陽(yáng)性血清的稀釋度低次為1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。④滴加對(duì)照孔取1：16稀釋的陰性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀釋的陽(yáng)性血清50微升加入第11孔；取稀釋液50微升加入第12孔。⑤滴加正向血凝診斷液取正向血凝診斷液充分搖勻（瓶底應(yīng)無(wú)血球沉淀每孔各加25微升后立即置微量振蕩器上振1分鐘取下血凝板放在白紙上觀察每孔中的血球是否均勻（孔底應(yīng)無(wú)血球沉淀。如仍有部分孔底出現(xiàn)血球沉積，應(yīng)繼續(xù)振蕩直至完全混勻?yàn)橹?。⑥靜置（5~0置h果第2。⑦判定標(biāo)準(zhǔn)察0~2第0紅有%“+”第11孔為陽(yáng)性血清對(duì)照，應(yīng)出現(xiàn)“++”以上的凝集50%以上的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，證明該批正向診斷液的效價(jià)達(dá)到1：512為合格；第12孔為稀釋液對(duì)照，紅細(xì)胞也應(yīng)全部沉入孔底或只有“+”的凝集。“+血疫O平清17“+”“+（+~#）第8“+”的O為1：8。疫O中O到1：8受0個(gè)O。（2）用于鑒別診斷的正向間接血凝試驗(yàn)①稀釋待檢血清取管8支第1管液5，第2~8管各加稀釋液0.5毫升，取待檢血清0.5毫升加第1管取出05毫第2管第8管為14、1：8、1：6、1：32、1：64、1：18、1：26、1：52。②稀釋陰性對(duì)照血清管1液15毫清01升,即成1：16。③稀釋陽(yáng)性對(duì)照血清取中試管5支，列于管架，每管稀釋液4.9毫明OACa型和SVD這5血清0，成1：0。④滴加待檢血清和對(duì)照血清取第8管待檢血清加入血凝板上的1~5排第8孔取7管血清加入1~5排的第7孔取第6管血清加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔50微升。取陰性血清1：16稀釋度）加入1~5排的第10孔，每孔50微升。取1：500稀釋的陽(yáng)性血清加入1~5排的第11孔，每孔50微升。取稀釋液加入1~5排的第12孔，每孔50微升。⑤滴加正向間接血凝抗原（正向診斷液）第1排1~8孔和10~12孔加O型孔25微升。第二排1~8孔和10~12孔加A型血凝抗原，每孔25微升。第三排1~8孔和10~12孔加C型血凝抗原，每孔25微升。第四排1~8孔和10~12孔加Asia-1型血凝抗原，每孔25微升。第五排1~8孔和10~12孔加SD血原孔25微。抗立凝于振中速振蕩1分鐘使抗分，應(yīng)細(xì)淀。⑥靜置從振蕩器上取下血凝板放在試驗(yàn)臺(tái)上蓋上玻板室（15~30℃）靜置2小時(shí)，判定果若結(jié)不清或來(lái)及判，可放第2天判定。⑦判定標(biāo)準(zhǔn)先仔細(xì)觀察每排的10~12孔，10孔為陰性血清對(duì)照12孔為稀釋液對(duì)照，這2孔均應(yīng)無(wú)凝現(xiàn)象，僅出現(xiàn)“+”的凝集。11孔為口蹄疫4個(gè)型和水泡病1500“+”~“+，的5。察1~5排的第1~8孔，某排1~8孔，出現(xiàn)“#”~“++”的凝集，其余4排僅在1~3孔出現(xiàn)“++”~“+”的凝集，便可判定該份待檢血清為陽(yáng)性，其型別與所加的血凝抗原的型別相同。例出第1排的1~3“#第5“+第6“+，第7“+第8“—，判定該份待檢血清為口蹄疫O型，表明血清中存在O型抗體其效價(jià)為1：128。如果該份血清采自口蹄疫O型疫苗免疫過(guò)的動(dòng)物就不能判定究竟是自然感染產(chǎn)生的抗體還是接種過(guò)疫苗產(chǎn)生的抗體因?yàn)楸痉ㄉ胁荒軈^(qū)分感染性抗體和免疫性抗體為此欲使本法用于鑒別診斷，采血時(shí)必須要弄清該批動(dòng)物是否接種過(guò)口蹄疫或豬水泡病疫苗。⑧注意事項(xiàng)A．嚴(yán)重溶血和污染的血清樣品不宜檢測(cè)，以免產(chǎn)生非特異反應(yīng)。B．勿用90o和13o血凝板以誤。C第1~2第3~4現(xiàn)。D后10天則。注：稀釋液配方如下：NaHPO·12HO2 2NaHPO·2HO22 2NaCl

磷酸氫二) 35.8克（磷酸二氫)1.56克（氯化鈉） 8.5克NaN （迭氮鈉） 1.0克3加雙蒸水或去離子水至1000毫升15磅高壓滅菌20分鐘冷卻后取出980毫升加正常兔血清20毫升即成，置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｔ撆浞竭m用于正向間接血凝試驗(yàn)和反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)，也適用于豬瘟間接血凝試驗(yàn)。正向間接血凝抗原及其配套試劑由中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫綜防研究組提供。（二）口蹄疫中和試驗(yàn)病毒或毒素與相應(yīng)抗體結(jié)合后，能使其失去對(duì)易感動(dòng)物的致病力或?qū)?xì)胞的感染力稱為中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)不僅可在易感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行亦可在細(xì)胞培養(yǎng)或雞胚中進(jìn)行。1．細(xì)胞中和試驗(yàn)一般采用固定病毒稀釋血清法該法須在無(wú)菌條件下操作亦須細(xì)胞適應(yīng)毒。（1取兩列無(wú)菌試管第一列為正常血清對(duì)照組第二列為待檢血清中和組。先在二列試管中的第1管加含有0.5水解乳蛋白的漢克氏液（乳白液3毫升；第2~6管各加乳白液2毫升。（2取正常血清1毫升加入第一列的第1管取待檢血清1毫升加入第二列的第1管混勻后同對(duì)稀1~6管的正和檢清釋依為1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128。（3的1~6入置7溫0。

D毒2升，0（4種3，種1置37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3天，每日鏡檢一次并詳細(xì)記錄細(xì)胞病變情況。（5細(xì)胞培養(yǎng)3天后判定結(jié)果正常血清對(duì)照組的細(xì)胞應(yīng)全部出現(xiàn)病變中和組的血清18以上胞，陽(yáng)18的血清出現(xiàn)細(xì)胞病變則判為陰性該法特異性強(qiáng)結(jié)果可靠但要求無(wú)菌設(shè)備和培養(yǎng)細(xì)胞的條件操作繁瑣，基層難以應(yīng)用。2．乳鼠中和試驗(yàn)5~7日齡小白鼠對(duì)人工接種口蹄疫病毒易感染，產(chǎn)生特征性癥狀和規(guī)律性死亡。因此利用這一特性進(jìn)行乳鼠中和試驗(yàn)。操作步驟如下：（1）將待檢血清用生理鹽水或pH7.6的0.1MPBS稀釋成1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，分別與等量的10-3口蹄疫乳鼠適應(yīng)毒混合，37℃水浴保溫60分鐘。（2）每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰性血清（1：8）與10-3病毒的混合液作為病毒對(duì)照；已知陽(yáng)性血清與10-3病毒的混合液作為陽(yáng)性對(duì)照，處理方法同（1）步驟。（3）每一稀釋度血清中和組分別于頸背皮下接種5~7日齡乳鼠4照種2，2升/察5。（4準(zhǔn)，于8；照，。以護(hù)%。鼠。（三）口蹄疫乳鼠保護(hù)試驗(yàn)待檢血清稀釋成1：5，接種乳鼠后12小時(shí)或24小時(shí)，用1-3病毒攻毒，同時(shí)設(shè)陰性血清和已知陽(yáng)性血清（均為1：5稀釋）作為對(duì)照。觀察5天后判定結(jié)果在陰性和陽(yáng)性血清對(duì)照成立的前提下待檢血清組的乳鼠健活判定該份血清為陽(yáng)性，反之，則判為陰性。該法多用于定性檢測(cè)，一般不作為定量檢測(cè)手段。（四）口蹄疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)比。操作步驟如下：1稱取瓊脂糖或瓊膠素1克,迭氮鈉1克氯化鈉0.85克加pH7.6的0.01MPBS100毫升置沸水中煮熔化或15磅高壓10分鐘趁熱傾入平皿中厚度3~4毫米。2.瓊脂冷卻凝固后，用打孔器打成中央一孔周圍6孔的梅花形孔；中央孔徑4~5毫米，周圍孔徑3毫米與中央孔的孔距3~4毫米。3.中央孔加已知型別的濃縮抗原，四周孔加不同稀釋度的待檢血清和陰性、陽(yáng)性對(duì)照血清1：2稀釋，靜置擴(kuò)散1小時(shí)。4.移入濕盒內(nèi)于室溫或在37℃溫箱內(nèi)自由擴(kuò)散3~5天，也可放置于4~6℃冰箱內(nèi)擴(kuò)散。5.判定標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)沉淀線判陽(yáng)性，反之，則判為陰性。該法無(wú)需特殊儀器，設(shè)備通常用于定性檢測(cè)，但需時(shí)間長(zhǎng)，敏感性差，漏檢率高。（五）口蹄疫微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)．在U型24孔或96孔微量滴定板上每孔滴入生理鹽水100微升。．每孔滴入一份經(jīng)過(guò)56℃滅活30分鐘的待檢血清25微升。3．每板設(shè)已知陰性、陽(yáng)性血清2孔對(duì)照（與待檢血清試驗(yàn)條件相同。4．每孔滴入口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)抗原25微升。5．每孔滴入補(bǔ)體工作濃度50微升。振蕩30秒，37℃溫箱保溫40分鐘。6.每孔加溶血素工作濃度25微升和2%綿胞5微升蕩30秒于37℃溫30分。判照血應(yīng)。凡血不為。該敏定。（六）口蹄疫對(duì)流免疫電泳1.電泳槽內(nèi)的緩沖液為巴氏妥——巴氏妥鈉緩沖液。2.1克瓊脂糖加pH7.6的0.1MPBS100毫升加熱熔解后澆灌在5×13厘米玻板上厚度為0.6~0.8毫米，冷卻凝固后用打孔器制成二排孔，其距離為3~4毫米，每5對(duì)孔為一組，組間距離為10毫米。3.每組左邊孔，分別加O、A、C、Asua-1型和SVD濃縮抗原，每組右邊孔加1：2的待檢血清。每次試驗(yàn)