觀察小鼠睪丸染色體的數(shù)目及其形態(tài)特征實(shí)驗(yàn)報(bào)告 山東大學(xué)

山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2013年12科目細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目_觀察小鼠睪丸染色體的數(shù)目及其形態(tài)特征第1頁共4頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告·觀察小鼠睪丸染色體的數(shù)目及其形態(tài)特征【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握染色體的制備方法；2、觀察小鼠睪丸染色體的數(shù)目及其形態(tài)特征；3、認(rèn)識不同生物染色體的特征，學(xué)會做染色體組型圖【實(shí)驗(yàn)原理】(一)制作染色體標(biāo)本的先決條件：1、細(xì)胞具有旺盛的分裂能力（a.選擇活躍的組織如睪丸，骨髓。b.施加藥物使細(xì)胞分裂如PHA）2、設(shè)法得到大量中期細(xì)胞，秋水仙素處理。染色體特征：1.數(shù)目（2n=？）2.長度（絕對長度、相對長度）3.著絲粒位置（M\SM\ST\T）4.隨體與次溢痕的數(shù)目、大小和位置5.帶型分析(二)操作方法利用睪丸細(xì)胞的制片技術(shù)雖然需要離心以及細(xì)致的操作，但其基本程序是簡便的。在小鼠睪丸中，細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂比較旺盛，因此不需要體外培養(yǎng)就可以直接得到分裂中期細(xì)胞。通過小鼠睪丸得到染色體比較簡便，一般不需要無菌操作。用秋水仙素作為有絲分裂的抑制劑。由于小鼠睪丸細(xì)胞分裂活動(dòng)旺盛，具有高度的分裂能力，本實(shí)驗(yàn)采用這一材料，通過前處理，低滲，固定，制片，染色等步驟制得染色體標(biāo)本，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，可以進(jìn)行染色體組型分析。減數(shù)分裂是細(xì)胞分裂染色體數(shù)目減半時(shí)發(fā)生在性細(xì)胞的形成過程中。哺乳動(dòng)物在性成熟以后，精巢內(nèi)的性細(xì)胞總是在分批分期不斷的成熟，因此，對哺乳動(dòng)物的精巢進(jìn)行一定的技術(shù)處理，隨時(shí)都可以獲得減數(shù)分裂過程中各個(gè)時(shí)期染色體的標(biāo)本。用適量的秋水仙素溶液注入動(dòng)物腹腔內(nèi)，可以阻止分裂細(xì)胞紡錘絲的形成，從而積累大量處于分裂中期的細(xì)胞。利用上述原理，通過常規(guī)的制片方法，觀察小鼠睪丸細(xì)胞的染色體。(三)中期染色體的特征1、突出在紡錘絲的牽引下，染色體的著絲點(diǎn)集中到細(xì)胞中央的道板上；2、DNA高度螺旋化。短粗的染色體清晰可見，染色體數(shù)目形態(tài)穩(wěn)定，便于觀察；3、由于染色體高度集中，造成紡錘體清晰可見。通過本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，本實(shí)驗(yàn)要想做的較好不太容易，需要嫻熟的技術(shù)和耐心，(四)原理分析通過獲取小鼠睪丸細(xì)胞（分裂能力強(qiáng)），本實(shí)驗(yàn)采用這一材料，通過前處理，低滲，固定，制片，染色等步驟制得染色體標(biāo)本，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，可以進(jìn)行染色體組型分析。一般觀察有絲分裂中期，染色體的形態(tài)最典型、最易辨認(rèn)和區(qū)分。因此，制備染色體標(biāo)本獲取的是中期細(xì)胞?！緦?shí)驗(yàn)用品】材料小白鼠試劑秋水仙素、0.3%KCl低滲液、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、0.9%生理鹽水、檸檬酸鈉溶液器材注射器（1ml,5ml）、5號針頭、解剖盤、解剖剪、鑷子、玻璃吸管、10ml刻度的離心管、離心機(jī)、載玻片、蓋玻片、顯微鏡、濾紙、擦鏡紙、棉花、量筒、天平、恒溫水浴鍋【操作步驟】預(yù)處理→取睪丸→剪碎→離心→低滲→離心→固定→離心→固定→滴片→染色→觀察1．預(yù)處理：取雄性小鼠按每克體重注射4ug，給小白鼠注射秋水仙素，經(jīng)14-16h后，斷頭法殺死小鼠，去除睪丸用生理鹽水（0.9%的NaCl）洗去血污；2．放入裝有1ml0.3%KCl液的小燒杯中剪碎（呈乳白色）；3．用銅網(wǎng)過濾到刻度離心管中，再加0.3%KCl液至4ml；4．37℃靜置30min，進(jìn)行低滲處理；5．離心：800-1000r/min離心8min,棄上清6．加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹氣，輕輕打散細(xì)胞，固定8min；7．再以800-1000r/min離心8min；8.棄去上清液，加1ml固定液，制成細(xì)胞懸液固定5min；9.取清潔的低溫預(yù)冷載片，距10-15min高度滴下2-3滴細(xì)胞懸液，從一邊輕輕吹氣并隨時(shí)輕輕敲打，以使細(xì)胞均勻分布和促進(jìn)染色體展開；10.用濾紙擦去載片上多余液體，空氣干燥后染色20-30min，用自來水沖洗后可觀察；11.觀察：先用低倍鏡尋找細(xì)胞及中期分裂相，然后轉(zhuǎn)入高倍鏡下觀察并記錄。對實(shí)驗(yàn)步驟的分析簡介如下：1.預(yù)處理——為了取出小鼠的睪丸細(xì)胞，在此之前要進(jìn)行秋水仙素的注射，目的在于抑制紡錘絲的形成，使染色體排列在赤道板上，便于觀察，而不至于紡錘絲的牽引下移動(dòng)向細(xì)胞兩極；2.低滲——此步驟不能使細(xì)胞因吸水而漲破；3.離心——?jiǎng)?wù)必要控制在800-1000r/min，過大會使細(xì)胞漲破，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，時(shí)間也要控制，過長也會影響觀察；4.固定——用固定液固定小鼠睪丸細(xì)胞，使細(xì)胞達(dá)到我們想要的狀態(tài)；5.滴片——距10-15min高度滴下細(xì)胞懸液，并吹氣和敲打，目的在于使細(xì)胞均勻分布和促進(jìn)染色體展開；6.染色——采用倒置染色法，目的在于可使載玻片充分接觸染液，若有雜質(zhì)也可沉降至底部，不會和玻片直接接觸?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】勉強(qiáng)可以數(shù)，有一小塊染色體重疊。圖中染色體數(shù)為20【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】在此次試驗(yàn)中，我們主要出現(xiàn)了以下幾種問題：染色體凝縮程度不夠染色體沒有分散開染色較淺，有的甚至沒有染上顏色出現(xiàn)較多沒有漲破的細(xì)胞處于分裂中期的細(xì)胞數(shù)量太少，導(dǎo)致在看滴片時(shí)很難找到中期染色體由此分析導(dǎo)致出現(xiàn)這些問題或影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素可能有以下一些1.不同低滲時(shí)間的影響通過兩次實(shí)驗(yàn)并與其他組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較我們組比較了不同低滲時(shí)間對染色體制片的影響。低滲25min比第一次低滲的制片成功率稍高一些，但差異不明顯；而在制備良好率上，低滲25min的效果明顯優(yōu)于其他低滲時(shí)間（結(jié)合其他組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得到）。2.不同滴片高度的影響在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，一些染色體出現(xiàn)斷裂、染色體過于分散的情況，這在20和35cm的滴片高度下尤為明顯，而25cm滴片高度的制備成功率和良好率都明顯優(yōu)于其他高度3.秋水仙素處理的時(shí)間和用量：由于細(xì)胞分裂不同步，小鼠睪丸內(nèi)分裂中期細(xì)胞不多．所以一般在處死小鼠前要腹腔內(nèi)注射秋水仙素，它可抑制紡錘體的形成，讓細(xì)胞周期同步化，使同時(shí)達(dá)到中期的細(xì)胞增多，從而獲得大量的中期分裂相。本次我們組染色體標(biāo)本質(zhì)量不佳的一個(gè)重要原因就是秋水仙素處理不當(dāng)。因此秋水仙素處理時(shí)要注意：①注射的方法：應(yīng)廢左手提起腹部皮膚，右手拿注射器．針尖稍向上，進(jìn)針后有落空感，表示進(jìn)入腹腔。如果將秋水仙素注射在皮下，會影響小鼠的吸收．導(dǎo)致中期細(xì)胞的數(shù)量減少；我們在注射時(shí)發(fā)現(xiàn)部分秋水仙素流出，而且伴有血跡，因此推測可能注射部位不當(dāng)，傷到了小鼠的脾臟等器官②秋水仙素處理的時(shí)間和用量：一般處理時(shí)間16h．處理時(shí)間過長或用量過高，染色體過分收縮或著絲粒分離，染色體短?。踔疗扑?。處理時(shí)間過短或注射用量不夠．不能阻斷細(xì)胞分裂，導(dǎo)致中期分裂相減少。我們本次試驗(yàn)主要是出現(xiàn)了第①種問題4.低滲：低滲的作用是使細(xì)胞吸水膨脹，使其在制片時(shí)細(xì)胞易破裂利于染色體分散。本次低滲采用的是濃度為0.3%的KCl，水浴溫度與動(dòng)物體溫一致，小白鼠為37度，水浴時(shí)間20min。低滲液使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)熱防止溫度變化使細(xì)胞低滲效果不好。低滲時(shí)問不宜過長，溫度不宜過高，否則會使細(xì)胞提前破裂，造成細(xì)胞和中期分裂相大量丟失而較少，低滲時(shí)間過短，溫度過低，細(xì)胞膨脹不足，造成制片后染色體分散不好，多重疊。在第一次試驗(yàn)時(shí)我們不僅在低滲時(shí)間上沒有達(dá)到應(yīng)有的長度，而且溫度上也過低，導(dǎo)致第一次實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)大量沒有漲破的細(xì)胞，即使?jié)q破染色體也凝聚成團(tuán)狀，影響了觀察。固定液的使用：固定時(shí)間要足夠，固定作用不足，染色體出現(xiàn)邊緣發(fā)毛，結(jié)構(gòu)不清晰。加入固定液混勻細(xì)胞時(shí)用力也要適當(dāng)，如果過猛，會使細(xì)胞破碎，染色體丟失，用力不夠，細(xì)胞不易打散而成團(tuán)塊。通過照片顯示染色體邊緣不清晰可能是固定時(shí)間不夠?qū)е碌纹旱纹瑫r(shí)細(xì)胞懸液的濃度和滴數(shù)均可以影響細(xì)胞的多少，如在制作細(xì)胞懸液時(shí)，加入新鮮固定液太少，濃度大，制片后細(xì)胞密集，增加觀察難度，如果加入新鮮固定液太多，細(xì)胞懸液太稀釋，制片后細(xì)胞少，分裂相少?！咀⒁馐马?xiàng)】(一)制備方法要點(diǎn):1.用一定劑量的秋水仙素破壞紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停滯在中期,使中期染色體停留在赤道面處；2.用低滲法使將細(xì)胞膨脹,以至于在滴片時(shí)細(xì)胞被脹破,使細(xì)胞的染色體鋪展到載玻片上，低滲與離心等步驟的操作要輕；3.空氣干燥法可使使細(xì)胞的染色體在載片上展平,經(jīng)Giemsa染色后便可觀察到染色體的顯微圖象。(二)觀察細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為：1．細(xì)胞完整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上；2．染色體形態(tài)和分布良好，最好無