殼聚糖固定化超氧化物歧化酶的制備及酶學(xué)性質(zhì)研究

殼聚糖固定化超氧化物歧化酶的制備及酶學(xué)性質(zhì)研究

超氧化物誘導(dǎo)酶是一種廣泛存在于生物中的金屬酶。它可以在細(xì)胞外的各種疾病和發(fā)展中找到超氧化物離子自由基（o2-c），具有抗炎、腫瘤、抗炎、輻射、抗炎、抗炎、抗炎、抗炎、抗炎、抗炎、抗炎等功效。廣泛應(yīng)用于水果、食品、藥物等領(lǐng)域。將其固定化,不但能保持原有酶活性,而且穩(wěn)定性也有所提高,還兼有可回收和反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn),固定化酶可進(jìn)一步組裝為酶?jìng)鞲衅鳌?guó)內(nèi)外有關(guān)的研究報(bào)道很多,但在尋找酶固定化的載體方面,仍未有理想的結(jié)果。殼聚糖對(duì)于固定荷電負(fù)性酶尤其以荷電負(fù)性的物質(zhì)為底物的酶具有獨(dú)特的作用。且目前植物中提取SOD的固定化研究較少。本研究以殼聚糖作為載體,固定化從樹(shù)莓中提取的超氧化物歧化酶,進(jìn)行有關(guān)其對(duì)貯存、熱、pH的穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)研究的結(jié)果。1材料和方法1.1utase樹(shù)莓提取超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,以下簡(jiǎn)稱SOD)樹(shù)莓中提取;殼聚糖上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品,脫乙酰度≥90.0%,粘度<100cps;其他試劑均為分析純?cè)噭?.2方法1.2.1sod酶濃縮液的制備取一定量樹(shù)莓,加100ml50mmol/L磷酸鹽緩沖液,在冰浴條件下研磨,9500r/min離心20min,取上清液加50%(NH4)2SO44℃靜置2h,12000r/min離心30min去除沉淀,留取上清液用90%(NH4)2SO4鹽析2h,12000r/min離心40min,棄去上清液,沉淀用適量50mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解,透析過(guò)夜,透析液經(jīng)濃縮后12000r/min離心30min,得到SOD酶濃縮液,酶濃縮液過(guò)SephadexG-100,收集酶活性部分。1.2.2sed活力測(cè)試NBT光還原法,以抑制NBT光還原的50%的酶液量作為一個(gè)酶活力單位(U)。1.2.3固定化sod制備1.2.3.殼聚糖的制備取一定量的殼聚糖溶于2%的乙酸水溶液中,在快速攪拌下,滴加5%的氫氧化鈉水溶液至溶液pH7.5,抽濾收集沉淀,可得殼聚糖的白色細(xì)小顆粒。將上述經(jīng)過(guò)再沉淀處理后的殼聚糖加入一定量的超氧化物歧化酶攪拌均勻后,再滴加一定量的戊二醛水溶液,在10℃條件下振蕩反應(yīng)10h。抽濾,先用蒸餾水洗滌,再用磷酸鹽緩沖液洗滌,直至洗滌液中檢測(cè)不到戊二醛和游離酶,即得顆粒狀固定化酶。1.2.3.超細(xì)顆粒的制備取一定量的殼聚糖溶于1%的乙酸水溶液中,在磁力攪拌下,滴加2%的氫氧化鈉水溶液至溶液pH5.5后,加入一定量的戊二醛水溶液反應(yīng)lh,然后再在快速攪拌下滴加5%的氫氧化鈉水溶液至溶液pH7.5,抽濾,收集沉淀,可得預(yù)交聯(lián)的網(wǎng)狀殼聚糖的細(xì)小顆粒。超氧化物歧化酶固定化操作方法同上。以U/g載體表示固定化酶酶活力。1.2.4最佳固定化條件的確定1.2.4.超氧化物歧化酶的制備固定化反應(yīng)中,固定戊二醛終濃度0.5%。網(wǎng)狀殼聚糖載體制備過(guò)程中,其他條件不變,分別加入不同量的戊二醛水溶液使其終濃度為0.2%、0.6%、1%、1.4%、1.8%,將其分別作為載體固定超氧化物歧化酶,測(cè)定酶活力及酶活回收率。1.2.4.固定化酶酶活回收率測(cè)定分別以線型殼聚糖和網(wǎng)狀殼聚糖作為載體,加入一定量的SOD溶液攪拌均勻后,再分別滴加一定量的戊二醛水溶液,使戊二醛濃度分別為0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%,分別測(cè)定固定化酶酶活回收率。1.2.4.3.固定化sod載體的篩選在最佳制備條件下分別制備線型殼聚糖載體和網(wǎng)狀殼聚糖載體,將其用于SOD固定化,測(cè)定固定化酶酶活力及酶活回收率。1.2.5溶液酶和固定化酶的儲(chǔ)存性能將等酶活力單位的溶液酶和固定化酶分別在4℃下保存,間隔取樣測(cè)定相對(duì)酶活力。1.2.6測(cè)定固定化酶連續(xù)使用的穩(wěn)定性將固定化酶室溫下保存一定時(shí)間后測(cè)定其酶活力,將該酶回收后測(cè)定其酶活力及酶活回收率。1.2.7固定化酶的穩(wěn)定試驗(yàn)將固定化酶及溶液酶置于梯度溫度的水浴鍋中,40min后測(cè)定固定化酶及溶液酶相對(duì)酶活力。1.2.8固定化酶的ph穩(wěn)定試驗(yàn)固定化酶在不同pH值緩沖液條件下,30℃保溫40min,測(cè)定固定化酶相對(duì)酶活力,溶液SOD作為對(duì)照。2結(jié)果與分析2.1最佳固定化條件的確定2.1.1醛用量對(duì)固定化物歧化酶活力的影響網(wǎng)狀殼聚糖載體制備過(guò)程中,其他條件不變,分別加入不同量的戊二醛水溶液使其濃度為0.2%、0.6%、1%、1.4%、1.8%,將其分別作為載體固定超氧化物歧化酶,由圖1可知,載體制備過(guò)程中,戊二醛濃度為1%時(shí),所制備的固定化酶活力較高。2.1.2固定化反應(yīng)中戊二醛加量對(duì)固定化酶酶活回收率的影響以網(wǎng)狀殼聚糖作為載體,加入一定量的SOD溶液攪拌均勻后,再分別滴加一定量的戊二醛水溶液,使戊二醛濃度分別為0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%,結(jié)果如圖2所示,固定化反應(yīng)中戊二醛加量為0.1%時(shí),所得固定化酶酶活回收率較高。以線型殼聚糖作為載體,加入一定量的SOD溶液攪拌均勻后,再分別滴加一定量的戊二醛水溶液,使戊二醛濃度分別為0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%,結(jié)果如圖3所示,固定化反應(yīng)中戊二醛加量為0.1%時(shí),所得固定化酶酶活回收率較高。2.1.3sod酶活力及回收率由表1可知,在固定化SOD活力測(cè)定結(jié)果中,以線型殼聚糖作為載體制備的固定化SOD雖可得到酶活,但酶活力及回收率相對(duì)較低,以網(wǎng)狀殼聚糖作為載體制備的固定化SOD,酶活力和酶活回收率均較理想。選擇以網(wǎng)狀殼聚糖作為載體制備的固定化SOD進(jìn)行后序酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定。2.2固定劑為單一溶劑后相對(duì)酶活測(cè)定將等酶活力單位的溶液酶和固定化酶分別在4℃放置一定時(shí)間后,相對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4,圖4表明溶液酶易于失活,而SOD經(jīng)殼聚糖固定化后,可以較長(zhǎng)時(shí)間保持很高的活力。2.3次回收固定化酶對(duì)sod相對(duì)酶活力的影響固定化酶室溫下保存一定時(shí)間后測(cè)定其酶活力,將酶回收后測(cè)定其相對(duì)酶活力,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,表2表明,二次回收固定化酶酶活回收率在50%以上,SOD經(jīng)殼聚糖固定化后可反復(fù)使用,提高酶的利用價(jià)值。2.4酶及溶液酶相對(duì)酶活力將固定化酶及溶液酶置于梯度溫度的水浴鍋中,40min后測(cè)定固定化酶及溶液酶相對(duì)酶活力。測(cè)定結(jié)果如圖5所示,溶液酶呈下降趨勢(shì),隨溫度升高,溶液酶迅速失活,相對(duì)溶液酶,固定化酶相對(duì)酶活力變化較緩,溫度對(duì)固定化酶影響較小,由圖可知固定化酶耐熱穩(wěn)定性較溶液酶有所提高。2.5極端酸性條件下溶液酶及固定化酶的激活固定化酶在不同pH值緩沖液條件下,30℃保溫40min,測(cè)定固定化酶相對(duì)酶活力,溶液SOD作對(duì)照。由圖6可知極端酸性條件對(duì)溶液酶及固定化酶有一定激活作用,溶液酶在偏堿條件下酶活較高,堿性條件酶活損失,固定化酶在酸性條件下酶活較高,耐酸穩(wěn)定性有所提高,堿性條件下酶活有一定損失。由圖可知固定化酶在極端酸性條件下穩(wěn)定性較溶液酶有較大提高。3固定化酶的使用殼聚糖來(lái)源豐富,無(wú)毒,無(wú)抗原性,化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定,具有降血脂、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫等功能,是性能良好的固定化酶載體,具備規(guī)模生產(chǎn)的條件。樹(shù)莓中超氧化物歧化酶含量較高,且酶金屬構(gòu)象不同于其它酶。因此將樹(shù)莓超氧化物歧化酶進(jìn)行固定化研究具有現(xiàn)實(shí)意義。目前,殼聚糖作為固定化酶載體應(yīng)用于固定化SOD的研究較少。篩選適合的殼聚糖及處理方法對(duì)SOD進(jìn)行固定化,制得殼聚糖固定化SOD的研究不但能保持原有酶活性,而且酶穩(wěn)定性也有所提高,還兼有可回收和反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn),固定化酶可進(jìn)一步組裝為SOD酶?jìng)鞲衅?用于清除超氧陰離子自由基藥物的篩選。本實(shí)驗(yàn)制備了兩種以殼聚糖為載體固定樹(shù)莓SOD的固定化酶,以線型殼聚糖作為載體制得的固定化酶沒(méi)能得到酶活較高的固定化SOD,可能是由于固定化酶表面帶上負(fù)電荷,會(huì)對(duì)O2-·產(chǎn)生靜電排斥,阻礙O2-·與SOD活性中心的接觸,進(jìn)而測(cè)得SOD活性較低。以網(wǎng)狀殼聚糖制得的固定化酶位于載體殼聚糖的表面,無(wú)空間位阻,另外預(yù)交聯(lián)的網(wǎng)狀殼聚糖結(jié)構(gòu)緊密適于穩(wěn)定酶構(gòu)象,酶活回收率較高。本研究比較了SOD固定化酶與溶液酶的酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明SOD經(jīng)殼聚糖固定化后穩(wěn)定性提高。SOD固定化酶與溶液酶相比,可以較長(zhǎng)時(shí)間保持很高的酶活力;SOD固定化酶可以反復(fù)使用,二次回收的固定化酶酶活回收率可達(dá)到50%以上;在梯度水浴保溫,SOD固定化酶的相對(duì)酶活力穩(wěn)定性高于溶液酶;在極端pH值溶液條件下,SOD固定化酶的穩(wěn)定性均有所增強(qiáng)。這可能是由