高中生物《第五章-第三節(jié)-血紅蛋白的提取和分離》課件6-新人教版選修1

本課題學習目標

體驗從復雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。主要原理：

①凝膠色譜法分離蛋白質的原理

②電泳法分離樣品的原理

③緩沖溶液的組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法

4、課題難點：

①樣品的處理

②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。1.分離生物大分子的基本思路：

選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。2.蛋白質分離和提取的原理：根據(jù)蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附性質和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質。一、血紅蛋白的提取和分離3、提取分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法

（一）凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠：

大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構成的多孔小球體，內部有許多貫穿的通道。根據(jù)被分離物質的蛋白質相對分子質量的大小，利用具有網(wǎng)狀結構的凝膠，來進行分離。1.概念：3.凝膠色譜法的原理①當相對分子量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢;②相對分子量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。③依據(jù)的特性是：蛋白質分子量的大小。4.凝膠色譜法分離蛋白質的原理和具體過程凝膠色譜法分離蛋白質過程的動畫演示

（二）緩沖溶液

1.概念:在一定的范圍內，凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:思考：說出人體血液中緩沖對。

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內使用的緩沖液。

4.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,利用緩沖液模擬細胞內的PH環(huán)境，保證

血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察(紅色)和科學研究(活性)磷酸緩沖液3.緩沖溶液的配制:其目的是:（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。影響蛋白質分子運動速度的因素

決定運動方向形成庫侖力形成阻力決定運動速率電荷性質電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。

在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖

聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、測定蛋白質分子量:常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結構的凝膠。N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應

蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。2.原理：

SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。3.SDS作用機理:用SDS測定蛋白質分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。

二、實驗操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理：（一）蛋白質提取和分離步驟（二）操作過程可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。血液血漿水分固體物質：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵血紅素基團2.提問：血液有哪些成分？

1.提問：用雞的紅細胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提??；人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵血紅素基團每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子O2或一分子CO2，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點：(1)紅細胞的洗滌:去除雜質蛋白，利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化.1、采集血樣2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：下層暗紅色的紅細胞+五倍體積的0.9％的NaCl溶液洗滌，攪拌10min5、低速短時間離心：6、重復3、4、5步驟三次上清液中已沒有黃色：紅細胞洗滌干凈。①目的:②操作：洗滌次數(shù)過少,無法除去血漿蛋白。(2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，加40％體積的甲苯

（溶解細胞膜）置于磁力攪拌器攪拌10min（加速細胞破裂）紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。③分離：濾紙過濾：除去脂溶性沉淀層，分液漏斗中靜置：分出下層的紅色透明液體。甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次(4)透析：①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12h②目的：除去樣品中分子量較小的雜質和離子?；蛴糜诟鼡Q樣品的緩沖液。20mmol/L磷酸緩沖液1mL透析過程動畫演示2.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端磨平。②底塞的制作：

打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)