《DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)》課件（新人教版選修1）

新課標(biāo)人教版課件系列《高中生物》選修１新課標(biāo)人教版課件系列《高中生物》1專題５

《DNA和蛋白質(zhì)

技術(shù)》專題５

《DNA和蛋白質(zhì)

技術(shù)》2教學(xué)目標(biāo)

知識(shí)與能力１、通過嘗試對植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取，２、了解DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，尤其是DNA的溶解性；３、理解DNA粗提取以及DNA鑒定的原理。４、二苯胺法鑒定DNA的方法和原理?！菊n題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。課題難點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。教學(xué)目標(biāo)知識(shí)與能力3課題１

《DNA的粗提取與

鑒定》專題５《DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)》課題１

《DNA的粗提取與

鑒定》專題５《DNA和蛋4復(fù)習(xí)鞏固:(1)如何觀察DNA和RNA在真核細(xì)胞中的分布情況?(2)真核細(xì)胞DNA的主要存在場所?(3)證明DNA是遺傳物質(zhì)的三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?(4)DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的提出者是誰?(5)DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的主要特點(diǎn)?1、DNA分子由兩條鏈組成,這兩條鏈按反向平行的方式盤旋成雙螺旋結(jié)構(gòu).2、DNA分子中的磷酸和脫氧核糖交替連接.排列在外側(cè),構(gòu)成基本骨架,堿基排列在內(nèi)側(cè).3、DNA分子兩條鏈上的堿基通過氫鍵連接成堿基對.復(fù)習(xí)鞏固:1、DNA分子由兩條鏈組成,這兩條鏈按反向平行的方51、你所知道的生物大分子有哪些?2、如何來提取生物大分子?3、提取DNA的基本思路是什么?4、可以將DNA溶解于水和其他物質(zhì)分離開來的方法嗎?學(xué)生活動(dòng)1:一、基礎(chǔ)知識(shí)1、你所知道的生物大分子有哪些?2、如何來提取生物大分子?36①根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最小；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。②如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol／L時(shí)，DNA的溶解度最大，濃度為0．14mol／L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。①根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下71、DNA能溶于酒精溶液嗎？2、細(xì)胞中的其它物質(zhì)呢？3、由此你想到了什么?4、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性?學(xué)生活動(dòng)2:1、DNA能溶于酒精溶液嗎？2、細(xì)胞中的其它物質(zhì)呢？3、由此8二、實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取1、材料：魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取2～3種實(shí)驗(yàn)材料）2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大二、實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取1、材料：魚卵、豬9（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液學(xué)生活動(dòng)3:1、怎樣使雞血細(xì)胞破裂？原理是什么？2、如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞又該如何處理？3、加洗滌劑和食鹽的作用是什么？4、提取洋蔥DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行從分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。如果研磨不充分，會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液學(xué)生活動(dòng)3:1、怎樣使雞血10（三）去除濾液中的雜質(zhì)探究活動(dòng)4:1、此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？2、為了純化提取的DNA需要將濾液作怎樣的進(jìn)一步處理？3、為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？4、方案二和方案三的原理有什么不同？（三）去除濾液中的雜質(zhì)探究活動(dòng)4:1、此步驟獲得的濾液中可能11（四）DNA的析出與鑒定學(xué)生活動(dòng)4:3、如何鑒定DNA分子？應(yīng)注意什么？根據(jù)你前面所學(xué)的知識(shí)，還可以用什么物質(zhì)來鑒定？2、純的DNA應(yīng)該是什么顏色？1、怎樣使雞血細(xì)胞破裂？原理是什么？（四）DNA的析出與鑒定學(xué)生活動(dòng)4:3、如何鑒定DNA分子12

1.制雞血細(xì)胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）0.1g/mL檸檬酸鈉100mL活雞鮮血180mL500mL燒杯中，玻棒攪拌，離心、分離或靜置沉淀。2.提取DNA。①取血細(xì)胞5-10mL＋20mL蒸餾水，用玻棒沿一個(gè)方向快速攪拌。②紗布過濾：濾液中含DNA和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。⑴.提取血細(xì)胞核物質(zhì)：⑵.溶解核內(nèi)的DNA：濾液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.制雞血細(xì)胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）0.1g/mL13⑶.析出含DNA的粘稠物：⑷.濾取含DNA的粘稠物：⑸.DNA粘稠物的再溶解：在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個(gè)方向輕輕攪拌，出現(xiàn)絲狀物；當(dāng)絲狀物不在增加時(shí)，停止加水（此時(shí)NaCl溶液的濃度相當(dāng)于0.14mol/L）。用多層紗布過濾，含DNA的粘稠物留在紗布上。20mL2mol/L的NaCl溶液步驟⑷含DNA的粘稠物在20mL燒杯中輕緩攪拌3min，使盡可能多的DNA溶解在NaCl溶液。⑹.過濾含有DNA的NaCl溶液：用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟⑸所得的溶液，濾液中含有DNA。⑶.析出含DNA的粘稠物：⑷.濾取含DNA的粘稠物：⑸.D14⑺.提取含有雜質(zhì)較少的DNA：步驟⑹所得的濾液＋體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精50mL，用玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。3.DNA的鑒定：加入二苯胺試劑4mL，用玻棒攪拌使DNA溶解，沸水浴5min，觀察溶液是否出現(xiàn)淺藍(lán)色。1.共有“三次過濾，兩次析出，七次攪拌”2.加入“兩次蒸餾水，三次NaCl溶液，一次酒精”三、實(shí)驗(yàn)小結(jié)⑺.提取含有雜質(zhì)較少的DNA：步驟⑹所得的濾液＋體積分?jǐn)?shù)為915四、實(shí)驗(yàn)原理拓展介紹。1.DNA的釋放。DNA主要在雞血細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，正常情況下不會(huì)釋放出來，蒸餾水對于雞血細(xì)胞是一種低滲液，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞，使之脹破，同時(shí)加上玻璃棒快速攪拌的機(jī)械作用，加速血細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜的破裂。但釋放出來的大量DNA與RNA、蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，即釋放的不是純凈的DNA，常稱為DNA核蛋白。2.DNA與蛋白質(zhì)分離。在高濃度（2mol/L）的氯化鈉溶液中，核蛋白易溶解，析出DNA并溶解在高濃度的氯化鈉溶液中3.DNA的析出與獲取。因?yàn)镈NA在低濃度（0.14mol/L

）的氯化鈉溶液中溶解度小，而蛋白質(zhì)的在其中的溶解度大。所以在向含DNA的高濃度的氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化鈉溶液，從而使DNA溶解度下降，蛋白質(zhì)溶解度增高。四、實(shí)驗(yàn)原理拓展介紹。1.DNA的釋放。DNA主要在雞血細(xì)164.DNA的再溶解。用高濃度（2mol/L）的氯化鈉溶液再溶解DNA粘稠物。5.DNA的沉淀和濃縮。對于除去了蛋白質(zhì)的DNA的氯化鈉溶液，必須再進(jìn)一步沉淀和濃縮，常用酒精沉淀法。即往含有Na＋的DNA溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精，混勻后可以使DNA沉淀、濃縮，形成含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物，懸浮于溶液中。若絲狀物較少，可將混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘即可。濃縮后的DNA絲狀物可以用玻棒（玻棒有吸附DNA的作用）緩緩旋轉(zhuǎn)的方法卷起。6.DNA的鑒定。100℃DNA＋二苯胺藍(lán)色物鑒定時(shí)藍(lán)色的深淺與溶液中DNA的含量多少有關(guān)。4.DNA的再溶解。用高濃度（2mol/L）的氯化鈉溶液再溶17方法步驟

加入物質(zhì)

目的

1.制備雞血細(xì)胞液

檸檬酸鈉溶液

①

2.提取雞血細(xì)胞細(xì)胞核物質(zhì)

20m1蒸餾水

②

3.溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA

2m1／L的NaCI溶液40mL

③

4.析出含DNA的黏稠物

蒸餾水

④

5.濾取含DNA的黏稠物

⑤

6.將DNA的黏稠物再溶解

2mol／L的NaCl溶液20mL

⑥

7.過濾含DNA的NaCl溶液

⑦

8.提取含有雜質(zhì)較少的DNA

冷卻的95％的酒精50mL

⑧

A:(1)向試管中加入0.015mol／L的NaCl溶液5mL

(2)加入DNA

(3)4mL二苯胺試劑

9.DNA的鑒定

B:(1)向試管中加入0.015mol／L

的NaCl溶液5mL

(2)4mL二苯胺試劑

⑨

方法步驟加入物質(zhì)目的1.制備雞血細(xì)胞液檸檬酸鈉溶液18①加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固②加速血細(xì)胞破裂

③溶解DNA

④使2mol/L的NaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大限度地釋出

⑤使含DNA的黏稠物被留在紗布上⑥使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中⑦除去含DNA的濾液中的雜質(zhì)⑧提取DNA⑨A出現(xiàn)藍(lán)色B無變化①加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固②加速血細(xì)胞破裂③溶解192.實(shí)驗(yàn)中NaCl的物質(zhì)的量濃度為2mol／L和0.14mol／L對DNA有何影響?1.在DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)過程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是()。A.稀釋血液、沖洗樣品B.使血細(xì)胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出C.使血細(xì)胞破裂、增大DNA溶解量D.使血細(xì)胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的DNA答：B答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出2.實(shí)驗(yàn)中NaCl的物質(zhì)的量濃度為2mol／L和0.14203.DNA遇二苯胺(沸水浴)會(huì)染成()A.磚紅色B.橘黃色C.紫色D.藍(lán)色4.提取雞血中的DNA時(shí)，為什么要除去血液中的上清液?答：DNA的提取，關(guān)鍵是對雜質(zhì)的去除，由于上清液是血液中的血漿部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白質(zhì))。答：D3.DNA遇二苯胺(沸水浴)會(huì)染成()4.提取雞血21課題２

《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

DNA片斷》專題５《DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)》課題２

《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

DNA片斷》專題５22一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）、PCR技術(shù)的概念是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百份的DNA拷貝（二）、PCR技術(shù)的應(yīng)用遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）、PCR技術(shù)的概念23PCR的應(yīng)用1從藍(lán)藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶)清除人體內(nèi)細(xì)胞中自由基抗氧化、抗輻射、消炎、抗衰老、抗癌高壓氧中毒、肺氣腫、糖尿病、早衰食品、保健品、藥品、化妝品基因庫檢索SOD的序列

設(shè)計(jì)引物

以藍(lán)藻總DNA位模板做PCR獲得的基因片斷連接在表達(dá)載體原核表達(dá)蛋白PCR的應(yīng)用1從藍(lán)藻里面克隆SOD清除人體內(nèi)細(xì)胞中自由基基因24PCR的應(yīng)用2檢測粉末樣品是否含有炭疽桿菌炭疽菌恐慌，降臨美國，席卷全球生命力強(qiáng)、傳染快、發(fā)作快、死亡率高。有兩對引物是根據(jù)編碼炭疽桿菌EF因子的基因序列設(shè)計(jì)的，僅與各種炭疽桿菌的EF因子同源。PCR產(chǎn)物是1247bp和208bp的片斷。非炭疽桿菌均呈陰性。用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)2小時(shí)取培養(yǎng)液直接作PCRPCR的應(yīng)用2檢測粉末樣品是否含有炭疽桿菌炭疽菌恐慌，降臨25PCR的應(yīng)用3基因測序PCR的應(yīng)用3基因測序26一、基礎(chǔ)知識(shí)（三）、PCR技術(shù)的原理一、基礎(chǔ)知識(shí)（三）、PCR技術(shù)的原理271、體內(nèi)DNA復(fù)制的條件：解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化DNA子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3’端開始連接脫氧核苷酸變性（80-100）Taq聚合酶（耐高溫）20—30個(gè)核苷酸構(gòu)成,是一小段DNA或RNAATP提供能量1、體內(nèi)DNA復(fù)制的條件：解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DN282、DNA合成的方向（1）DNA單鏈兩端的命名①基本單位－脫氧核苷酸脫氧核糖磷酸T1號(hào)碳5號(hào)碳3號(hào)碳2、DNA合成的方向（1）DNA單鏈兩端的命名①基本單位－脫29連接

ATGCATGC5，端含磷酸基團(tuán)3，端（含羥基）3，端5，端②DNA單鏈兩端的命名連接ATGCATGC5，端含磷酸基團(tuán)3，端（含羥30（2）DNA聚合酶的特性DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。

2、DNA合成的方向（2）DNA聚合酶的特性DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA31（3）DNA合成的方向從子鏈由5’端向3’端延伸（3）DNA合成的方向從子鏈由5’端向3’端延伸323、DNA復(fù)制的前提

——是______________

用_________________方法

思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴(kuò)增DNA如何打開雙鏈？雙鏈的解開控制溫度3、DNA復(fù)制的前提

——是______________

用33DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）4、DNA分子的熱變性原理：PCR儀原理變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）4、34思考：高溫使DNA解旋，但普通DNA聚合酶會(huì)失活,

__________________找到耐高溫DNA聚合酶P21托馬斯.布魯克思考：高溫使DNA解旋，但普通DNA聚合酶會(huì)失活,

____355、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；③四種脫氧核苷酸；④耐高溫的聚合酶；⑤控制溫度，但不需解旋酶.5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；36以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率二、PCR的反應(yīng)過程1、循環(huán)之前的一次預(yù)變性2、PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率二、PCR的反應(yīng)過程137（1）變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。（2）復(fù)性：溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。（3）延伸：溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。二、PCR的反應(yīng)過程3、每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸（1）變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈38（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性39（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性40（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性41（2）PCR循環(huán)—復(fù)性55℃復(fù)性（2）PCR循環(huán)—復(fù)性55℃復(fù)性42（3）PCR循環(huán)—延伸（3）PCR循環(huán)—延伸43（3）PCR循環(huán)—延伸（3）PCR循環(huán)—延伸44（3）PCR循環(huán)—延伸（3）PCR循環(huán)—延伸45（3）PCR循環(huán)—延伸（3）PCR循環(huán)—延伸464、循環(huán)特點(diǎn)：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無引物存于兩個(gè)子代DNA分子中③其它子代DNA分子都為雙引物分子式④處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長1×2N①②練習(xí)：見課課練P79第10題4、循環(huán)特點(diǎn)：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)47二、實(shí)驗(yàn)步驟：①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁④離心10分鐘⑤將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序⑥電泳檢測PCR結(jié)果二、實(shí)驗(yàn)步驟：①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配48三、操作提示：

操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。2．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。目的：避免外源性DNA大量擴(kuò)增造成假陽性反應(yīng)。三、操作提示：操作提示目的：避免外源性DNA大量擴(kuò)增造成49四、結(jié)果分析與評價(jià)1、原理：DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰(圖5-11)?？梢岳肈NA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測定。四、結(jié)果分析與評價(jià)1、原理：DNA在260nm的紫外線波段有50四、結(jié)果分析與評價(jià)(了解)2、具體方法如下。1）．將樣品進(jìn)行50倍稀釋：取2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水。2）．以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)(圖5-12)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。3）．加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。4）．根據(jù)下面的公式計(jì)算DNA含量。DNA含量(μg/ml)=50x(260nm的讀數(shù))x稀釋倍數(shù)四、結(jié)果分析與評價(jià)(了解)2、具體方法如下。51五、課題延伸1、PCR優(yōu)點(diǎn)：2、PCR技術(shù)的意義原理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡單?？焖?、高效、靈活和易于操作五、課題延伸1、PCR優(yōu)點(diǎn)：原理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡單。52復(fù)習(xí)：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。復(fù)習(xí)：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PC53練習(xí)1、書本2、課課練練習(xí)1、書本54練習(xí)：見課課練P79第10題練習(xí)：見課課練P79第10題559下圖為PCR過程的前三次循環(huán)的圖解，請據(jù)圖回答：(])請將PCR緩沖液中提供的4種組分填寫在圖中的方框內(nèi)：(2)第一輪循環(huán)中變性是指_____________________________；復(fù)性是指__________________________________________________；延伸是指___________________________________________________。(3)假設(shè)PGR反應(yīng)中的DNA模板為P，第一輪循環(huán)的產(chǎn)物2個(gè)子代DNA為Nl，第二輪的產(chǎn)物4個(gè)子代DNA為N2，第二輪的產(chǎn)物8個(gè)子代DNA為N3，則Nl、N2、N3中分別含有模板DNA單鏈的DNA分子

，__________________、____________________個(gè)，若繼續(xù)循環(huán)36次，則N36中將有——個(gè)DNA分子含有模板DNA單鏈。(4)N3的8個(gè)DNA分子中①②是以N2中的_____________為模板復(fù)制而來的，③④是以N2中的

為模板復(fù)制而采的，⑤⑥是以N2中的

為模板復(fù)制而來的，⑦⑧是以N2中的

為模板復(fù)制而來的。從圖中可以看出，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于2個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增，原因是____________________________________________________練習(xí)：見課課練P79第10題9下圖為PCR過程的前三次循環(huán)的圖解，請據(jù)圖回答：練習(xí)：56練習(xí)二(課堂檢測)1、DNA單鏈的________末端為3,端,________末端為5,端,在DNA復(fù)制時(shí),引物從模板鏈的___端配對結(jié)合.在___________酶的作用下,引物提供____端,使子鏈向下延伸.2每次循環(huán)可以分為______________________這三個(gè)過程,對應(yīng)溫度分別為__________________.練習(xí)二(課堂檢測)1、DNA單鏈的________末端為3,57練習(xí)二(課堂檢測)3、一個(gè)DNA片段經(jīng)過30次循環(huán)后能形成________個(gè)這樣的片段.4依據(jù)DNA吸收紫外光的情況,用紫外分光光度計(jì)測得DNA=_____________________________練習(xí)二(課堂檢測)3、一個(gè)DNA片段經(jīng)過30次循環(huán)后能形成_58練習(xí)二(課堂檢測)答案練習(xí)二(課堂檢測)答案59練習(xí)二(課堂檢測)1、DNA單鏈的________末端為3,端,________末端為5,端,在DNA復(fù)制時(shí),引物從模板鏈的___端配對結(jié)合.在___________酶的作用下,引物提供____端,使子鏈向下延伸.2每次循環(huán)可以分為______________________這三個(gè)過程,對應(yīng)溫度分別為__________________.磷酸基團(tuán)羥基羥基DNA聚合3/變性、復(fù)性、延伸95℃、55℃、72℃練習(xí)二(課堂檢測)1、DNA單鏈的________末端為3,60練習(xí)二(課堂檢測)3、一個(gè)DNA片段經(jīng)過30次循環(huán)后能形成________個(gè)這樣的片段.4依據(jù)DNA吸收紫外光的情況,用紫外分光光度計(jì)測得DNA=_____________________________23050x(260nm的讀數(shù))x稀釋倍數(shù)練習(xí)二(課堂檢測)3、一個(gè)DNA片段經(jīng)過30次循環(huán)后能形成_61課題３

《血紅蛋白的提取和

分離》專題５《DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)》課題３

《血紅蛋白的提取和

分離》專題５《DNA和蛋62本課題學(xué)習(xí)目標(biāo)

體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2.主要原理：①凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理②電泳法分離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機(jī)理3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法

4、課題難點(diǎn)：①樣品的預(yù)處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。本課題學(xué)習(xí)目標(biāo)體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大63

2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成，這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息

蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成，這標(biāo)志64血液血漿水分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)2.提問：血液有哪些成分？1.提問：用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取；人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白血液血漿水分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)65血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點(diǎn)：血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞661.分離生物大分子的基本思路：

選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理：

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。一、血紅蛋白的提取和分離3.高溫滅菌和酒精滅菌的結(jié)果：使微生物的蛋白質(zhì)發(fā)生變性、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞。1.分離生物大分子的基本思路：選用一定的物理或化學(xué)的67（一）凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠：大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離。1.概念：3.凝膠色譜法的原理—分子篩效應(yīng)：①當(dāng)相對分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動(dòng)速度較慢;②而相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。③依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。（一）凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠：大684.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程69凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動(dòng)畫演示

凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動(dòng)畫演示

70

（二）緩沖溶液

1.概念:在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:3.緩沖溶液的配制:通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。

4.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)磷酸緩沖液（二）緩沖溶液1.概念:在一定的范圍71緩沖溶液的組成及分類①弱酸及其對應(yīng)的鹽：②弱堿及其對應(yīng)的鹽：③多元弱酸的酸式鹽及其對應(yīng)的次級(jí)鹽:H2CO3→NaHCO3；CH3COOH→CH3COONaNH3?H2O→NH4CL;NH4OH→NH4CLNaHCO3→Na2CO3；NaH2PO4→Na2HPO4

緩沖溶液由足夠濃度的共軛酸堿對組成。其中，能對抗外來強(qiáng)堿的稱為共軛酸；能對抗外來強(qiáng)酸的稱為共軛堿。這一共軛酸堿通常稱為緩沖對、緩沖劑或緩沖系。常見的緩沖對主要有如下三種類型：緩沖溶液的組成及分類①弱酸及其對應(yīng)的鹽：②弱堿及其對應(yīng)的72（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。②在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷73

在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳示意圖在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的74

聚丙稀酰胺凝膠電泳1、在測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚丙稀酰胺凝膠電泳1、在測定蛋白質(zhì)分子量75

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。

（SDS的作用）為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。2.原理：

聚丙稀酰胺凝膠電泳

SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。3.SDS作用機(jī)理:蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決2.原理76用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法使用SDS—聚丙烯77

二、實(shí)驗(yàn)操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理：（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過程

本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來分離血紅蛋白。(1)紅細(xì)胞的洗滌:①洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。②洗滌操作：

1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。二、實(shí)驗(yàn)操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理78采集得到雞血采集得到雞血79柜式離心機(jī)柜式離心機(jī)80初次離心后的結(jié)果初次離心后的結(jié)果813次洗滌后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果82(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：

①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

二、實(shí)驗(yàn)操作(2)血紅蛋白的釋放：加83磁力攪拌器磁力攪拌器84攪拌器轉(zhuǎn)子攪拌器轉(zhuǎn)子85攪拌器正在工作攪拌器正在工作86甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色87(4)透析：

①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

二、實(shí)驗(yàn)操作(4)透析：①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，88透析過程動(dòng)畫演示透析過程動(dòng)畫演示89利用透析袋透析利用透析袋透析902.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。2.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：①取長4091（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A92裝配好的凝膠柱裝配好的凝膠柱93

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50c94（3）樣品加入與洗脫

①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。（3）樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱95（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破96開始進(jìn)行層析開始進(jìn)行層析97收集得到的純化后的蛋白收集得到的純化后的蛋白98思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。

1、在血紅蛋白的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？

2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？

血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功99（三）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白純度。1.目的：

①丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺:用去離子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。②十二烷基硫酸鈉（SDS）:用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。③用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液。④TEMED：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。⑤用去離子水配制10%過硫酸銨：作用是提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。⑥Tris—甘氨酸電泳緩沖液：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。⑦樣品處理液：

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍(lán)，10%的甘油。⑧染色液：

0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。⑨脫色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。（三）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白100

1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。

2、TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。3、在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。注意事項(xiàng)：（三）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)101