球蟲(chóng)試驗(yàn)計(jì)劃

摘要：對(duì)南昌市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的成年雞腸道，采用飽和鹽水漂浮法檢查，同時(shí)從腸內(nèi)容物中獲取混合球蟲(chóng)卵囊。在制備好的瓊脂薄層的載玻片上滴加稀釋適度的混合卵囊液。在顯微鏡下用手術(shù)刀片小心切割瓊脂薄層，達(dá)到瓊脂薄層上僅剩單一卵囊的嚴(yán)格要求。把單一卵囊包裹后經(jīng)口感染雛雞，又從感染雛雞糞便中收集大量球蟲(chóng)卵囊待孢子化后再次重度感染雛雞，掌握該球蟲(chóng)蟲(chóng)株特征及感染雞的病理變化。結(jié)果表明：?jiǎn)温涯腋腥倦r雞，感染率為40%；經(jīng)增殖傳代球蟲(chóng)卵囊感染雛雞蟲(chóng)株，初步鑒定為雞堆型艾美耳球蟲(chóng)（Eimeriaacevulina）。關(guān)鍵詞：堆型艾美耳球蟲(chóng)；南昌株；分離；鑒定v1材料與方法1.1材料1.1.1混合球蟲(chóng)卵囊。從南昌市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)成年雞腸道內(nèi)容物獲取。1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物。1日齡雄性雛雞20只（購(gòu)自南昌青云譜區(qū)，熊坊鄉(xiāng)某孵化場(chǎng)）1.1.3試驗(yàn)藥品。重銘酸鉀（AR級(jí)），食用鹽（江西鹽業(yè)集團(tuán)公司），瓊脂條。1.1.4試驗(yàn)器械。生化培養(yǎng)箱，離心機(jī)，普通天平，內(nèi)光源生物顯微鏡，1000W雙聯(lián)電爐，數(shù)碼照相機(jī)，物測(cè)微尺和目測(cè)微尺，鋼鋁鍋，500mL搪瓷杯，60mL三角瓶，60目銅篩，260目尼綸篩，眼科鑷，膠頭吸管，250mL燒杯。1.2方法1.2.1飽和食鹽水與2.5%重銘酸鉀液的制備。以量筒量取清水1000mL至鋼鋁鍋內(nèi)，電爐加熱沸騰，倒入食鹽380g攪拌、溶解、冷卻、過(guò)濾即為飽和鹽水；以重銘酸鉀25g溶于1000mL清水中即為2.5%重銘酸鉀液。1.2.2混合球蟲(chóng)卵囊檢查、收集培養(yǎng)。取腸內(nèi)容物于搪瓷缸內(nèi)，加少量飽和鹽水搗碎攪拌成糊狀，再加65mL飽和鹽水?dāng)噭?，?jīng)60目銅篩和260目尼綸篩過(guò)濾，濾液盛滿(mǎn)60mL的三角瓶?jī)?nèi)并成凸形，靜置20min后載玻片觸及凸點(diǎn)迅速翻轉(zhuǎn)，在16X16倍顯微鏡下觀察尋找卵囊，發(fā)現(xiàn)大量卵囊后用膠頭吸管吸取上浮液于青霉素空瓶?jī)?nèi)，兌加2.5%重銘酸鉀液3mL，置30°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h備用。1.2.3雛雞的飼養(yǎng)與管理。雄性雛雞飼養(yǎng)于殺滅卵囊的紙盒內(nèi)或大鼠籠內(nèi)，飼喂新鮮小雞料和潔凈清水，每次做到先洗手后飼喂雛雞，杜絕意外球蟲(chóng)卵囊感染。1.2.4單卵囊分離。用天平秤取瓊脂條1g于250mL燒杯中，添加清水100mL，電爐加熱沸騰攪拌成透明狀，趁熱用膠頭吸管滴加膠凍液于載玻片上，待冷卻后再用膠頭吸管取已孢子化的混合球蟲(chóng)卵囊于成型的瓊脂薄層上，置顯微鏡下逐行尋找球蟲(chóng)卵囊，卵囊密度控制在每個(gè)視野約有5~7個(gè)，顯微鏡觀察下用手術(shù)刀片細(xì)心切割瓊脂薄層，使瓊脂薄層上僅留一個(gè)球蟲(chóng)卵囊，確認(rèn)一個(gè)卵囊后將該小塊瓊脂轉(zhuǎn)移置較大瓊脂薄層上并包裹好。1.2.5單卵囊感染。在助手協(xié)同下打開(kāi)雛雞喙，將包裹物經(jīng)口腔滴加少量清水確認(rèn)喂服。共感染10只7日齡雛雞，記錄感染時(shí)間，分籠飼養(yǎng)。1.2.6純種子代卵囊收集與感染。第4~8d開(kāi)始每天用飽和鹽水漂浮法檢查雛雞新鮮糞便，當(dāng)檢查有球蟲(chóng)卵囊時(shí)記錄雞只和排出卵囊時(shí)間并開(kāi)始收集卵囊。取新鮮雛雞糞便于500mL搪瓷杯內(nèi)，杯內(nèi)裝有，杯內(nèi)裝有一定量的5°C清水。待收集一定量糞便后，將搪瓷杯內(nèi)原有的清水傾去并搗碎成糊狀，加350mL清水混勻，經(jīng)60目銅篩及260目尼綸篩過(guò)濾，濾液分裝8支離心管，每支45mL，以2000r/min離心5min；留沉淀物，取少許沉淀物與10mL飽和食鹽水?dāng)嚢?。攪拌?支管歸裝于1支管。倒完沉淀物的7支離心管分別加10mL清水，以2000r/min離心5min，留含沉淀物離心管內(nèi)的上液棄沉渣，再兌加清水至45mL處，以2000r/min離心10min，棄上清液留沉淀溶液少許，這樣加清水重復(fù)離心洗凈，最后將富含卵囊沉淀液從離心管中用吸管吸出移入60mL三角瓶?jī)?nèi)［7］，加等量5%重銘酸鉀液置30C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1.2.7純種孢子化卵囊感染。膠頭吸管吸取含大量卵囊液，經(jīng)口感染12日齡雛雞10只，7d后每天剖檢2只雛雞，觀察腸道表面病變情況并照相。1.2.8蟲(chóng)株的鑒定。取少量已孢子化的球蟲(chóng)卵囊液于載玻片上，在16X40倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)該球蟲(chóng)卵囊有幾種形態(tài)，有無(wú)極粒、卵囊及孢子囊殘?bào)w、斯氏體等。用顯微測(cè)微尺測(cè)量卵囊大小及孢子囊大小，測(cè)量100個(gè)該卵囊，算出其卵囊大小的平均值及卵囊形狀指數(shù)，結(jié)合潛隱期及腸道表面病變部位，比對(duì)感染雛雞病理變化堆型艾美耳球蟲(chóng)多在上表皮層發(fā)育，并且同一發(fā)育階段的蟲(chóng)體聚集在一起；被損害的十二脂腸和小腸前段出現(xiàn)大量白色小斑點(diǎn)，引起腸道腫脹、出血。（2.4雛雞感染球蟲(chóng)卵囊蟲(chóng)株的鑒定采用1只感染成功的雛雞排出的卵囊，經(jīng)增殖傳代的球蟲(chóng)卵囊感染雛雞蟲(chóng)株，根據(jù)其特征，初步鑒定為雞堆型艾美耳球蟲(chóng)（Eimeriaacevulina）。（見(jiàn)下表）表1雞堆型艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriaacevulina)蟲(chóng)株的鑒定雞堆型艾美耳球蟲(chóng)卵囊特征3分析與討論3.1蟲(chóng)株分離技術(shù)的意義雛雞感染球蟲(chóng)在自然情況下多是混合感染，而以某一種占優(yōu)勢(shì)。由于不同的地理株在抗藥性和致病力之間都表現(xiàn)出不同的抗藥水平，所以為了研究的準(zhǔn)確性,往往應(yīng)用純種株進(jìn)行研究。球蟲(chóng)的單卵囊分離技術(shù)不但能保證所獲得的卵囊為純種，還可以進(jìn)行球蟲(chóng)種類(lèi)的鑒別和球蟲(chóng)純種體系的建立?？傊⒁粋€(gè)便捷可行的純種分離技術(shù)是對(duì)球蟲(chóng)深入研究的前提和保證［6。3.2試驗(yàn)體會(huì)在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，必須進(jìn)行嚴(yán)格消毒，保證試驗(yàn)所需的無(wú)毒環(huán)境;每次離心收集卵囊時(shí)，要反復(fù)離心，以洗凈鹽分避免損壞蟲(chóng)體；離心后，應(yīng)將離心管內(nèi)液面逐層檢查，以免由于離心時(shí)間不夠或轉(zhuǎn)數(shù)不足致使蟲(chóng)體未完全存在于某一液面層而造成卵囊的丟失；確認(rèn)瓊脂薄層上單卵囊時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則因?yàn)榄傊稍锒绊懹^察球蟲(chóng)卵囊，當(dāng)切割瓊脂薄層時(shí)一定要仔細(xì)小心；感染時(shí)，盡量在雛雞較餓時(shí)投服，避免由于其進(jìn)食過(guò)多而造成投喂困難；向雞口中滴入清水時(shí)要避免水從口中溢出，防止卵囊丟失。單卵囊感染后，雞糞中排出子代卵囊的時(shí)間往往要遲于最短潛隱期幾小時(shí)，在潛隱期之前清除糞便，一般在感染后前4d無(wú)須檢查糞便，以免浪費(fèi)試驗(yàn)用品和耗費(fèi)不必要的時(shí)間和精力。3.3堆型艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株的初步鑒定試驗(yàn)中單卵囊感染10只雛雞，受感染為4只。對(duì)其中1只受感染的雛雞中的球蟲(chóng)卵囊，經(jīng)復(fù)制增殖分離純化獲得堆型艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株。其他3只雛雞感染的是什么類(lèi)型球蟲(chóng)蟲(chóng)株還不得而知，如需掌握當(dāng)?shù)仉r雞患球蟲(chóng)種類(lèi)，試驗(yàn)方法同樣要逐一獲得結(jié)果。窄卵圓形23.2X17.3-15.7X13.119.5X15.2無(wú)色1.28兩層、光滑無(wú)抱子卵及卵囊殘?bào)w有1極粒有斯氏體19?24h十二指腸及小腸前段卵囊形狀卵囊大小(|±m(xù)2)平均大小(|±m(xù)2)卵囊顏色形狀指數(shù)卵囊壁殘?bào)w極粒斯氏體完成孢子化時(shí)間潛隱期寄生部位球蟲(chóng)單卵囊分離1.3.1蟲(chóng)卵收集從長(zhǎng)沙朗梨附近農(nóng)戶(hù)家采集病雞糞，取一部分雞糞漂浮鏡檢,可見(jiàn)有許多大小不一的球蟲(chóng)卵囊。將雞糞裝入離心管中，加水離心2次(2000r/min,10min)，傾去上清液，再加飽和食鹽水離心(2000r/min,10min)1次,雞糞渣沉于管底,卵囊漂浮于飽和食鹽水表面。用經(jīng)火焰消毒的鐵絲環(huán)將漂浮于飽和食鹽水表面的球蟲(chóng)卵囊打環(huán)入含25g/L重鉻酸鉀溶液的平皿中,保存于29°C的恒溫箱中2d?3d，得到混合種抱子化卵囊。1.3.2瓊脂糖薄板的制備將2g瓊脂倒入100mL小燒杯中，加水49mL,白糖1.5g,用水浴加熱法加熱到完全溶解即成40g/L瓊脂糖溶液。取40g/L的瓊脂糖溶液2mL均勻傾于干燥潔凈的載玻片上,4C冰箱放置30min后，另準(zhǔn)備一塊大玻璃板,涂少許甘油,將載玻片上已經(jīng)凝固的厚約1.5mm的瓊脂糖板轉(zhuǎn)移至大玻璃板上，于4C冰箱凍干,1d后即成瓊脂糖薄片,可用于單卵囊包被。臨用時(shí)再將大玻璃板上的瓊脂糖薄片轉(zhuǎn)移到干燥潔凈的載玻片上，便于顯微鏡下觀察。1.3.3球蟲(chóng)單卵囊的分離用潔凈滴管吸取25g/L重鉻酸鉀培養(yǎng)的球蟲(chóng)混合卵囊液，滴5滴于潔凈試管內(nèi),加生理鹽水稀釋至每滴只含1個(gè)?2個(gè)抱子化卵囊。滴1滴于干凈載玻片上，在低倍鏡下觀察，每個(gè)視野有1個(gè)?2個(gè)球蟲(chóng)卵囊。在顯微鏡觀察下,直接吸取卵囊。其方法是:右手持自制玻璃毛細(xì)吸管的尖端正對(duì)視野中的一個(gè)卵囊，將吸管向卵囊直伸過(guò)去，將一個(gè)卵囊吸上來(lái)。把毛細(xì)吸管中的液體滴落到鋪有瓊脂糖薄片的載玻片上，在顯微鏡下觀察，確定只有一個(gè)蟲(chóng)卵即可。用雙面刀片把載玻片上的只含一個(gè)球蟲(chóng)卵囊的瓊脂糖薄片輕輕切割成約1.5cmX1.5cm的小方塊,將此瓊脂糖薄片直接將單個(gè)卵囊包埋起來(lái)，雞球蟲(chóng)單卵囊分離即告成功。球種鑒別1.1兔糞的采集兔糞采集自九臺(tái)市九臺(tái)鎮(zhèn)郊及春陽(yáng)等鄉(xiāng),各鄉(xiāng)按自然村落分散采集兔的新鮮糞便，主要以1~4月齡幼兔為主，不拘其種類(lèi)，每只采集5~10g,共采集了兔糞68份,分別放入容器中，帶回實(shí)驗(yàn)室以備檢驗(yàn)。1.2培養(yǎng)方法用飽和鹽水將糞泡開(kāi)混勻，用60孔/寸的銅篩過(guò)濾，取漂浮上清液，以1500r/min離心10min,取其沉淀放入小試管中，加入2.5%重鉻酸鉀溶液，深約0.5cm,27°C恒溫箱中培養(yǎng)。1.3種類(lèi)鑒別培養(yǎng)12h后,做第一次檢查，以后每隔8~12h檢查1次，以確定子抱子形成最早時(shí)間,90h后停止培養(yǎng),用顯微鏡觀察其形態(tài)、顏色及內(nèi)殘?bào)w及用膜孔的有無(wú),同時(shí)用測(cè)微尺，測(cè)量卵囊的大小，以鑒別其種類(lèi)。致病性測(cè)定1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高原鼠兔捕自中國(guó)科學(xué)院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)定位站地區(qū)。2010年3月和6月分別活捕72只成體（雄體46只，體重為159.90土2.37g;雌體26只，體重為146.84土3.28g）和45只亞成體（雄體21只，體重為86.43土7.23g;雌體24只，體重為77.04土4.33g）。將高原鼠兔帶回實(shí)驗(yàn)室后，單只飼養(yǎng)于飼養(yǎng)籠內(nèi)。該籠具為全不銹鋼水沖式兔籠（40cmX30cmX22cm），兔籠底層有一可抽取的活動(dòng)托盤(pán)，可供收集糞便用。為準(zhǔn)確測(cè)定感染劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)個(gè)體的致死率，用于實(shí)驗(yàn)的全部個(gè)體均為無(wú)球蟲(chóng)感染個(gè)體。由于在不發(fā)生重復(fù)感染的情況下，球蟲(chóng)感染為自限性，為此，在實(shí)驗(yàn)前，每天沖洗飼養(yǎng)籠具，并在100C干烤1h。同時(shí)收集糞便，用常規(guī)飽和鹽水漂浮法檢查球蟲(chóng)卵囊。若連續(xù)3d未從糞便中監(jiān)測(cè)到球蟲(chóng)的個(gè)體，被認(rèn)為是無(wú)球蟲(chóng)感染個(gè)體，備選用于實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)期間，給動(dòng)物提供充足的兔顆粒飼料（北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心生產(chǎn)）和飲水，并附加少量胡蘿卜。室溫和光周期均為自然環(huán)境的溫度和光照。1.2混合球蟲(chóng)2009年6月在疑似球蟲(chóng)病死亡的2只高原鼠兔的腸道內(nèi)容物中，用常規(guī)的飽和鹽水漂浮法分離出球蟲(chóng)卵囊，加入2.5%的重鉻酸鉀溶液，置于27^土0.5°C的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至抱子化。之后，經(jīng)多次卵囊增殖，最后獲得E.cryptobarretti和E.klondikensis的混合球蟲(chóng)卵囊（在混合卵囊中分別占69%和31%）。1.3實(shí)驗(yàn)處理為測(cè)定球蟲(chóng)對(duì)成體的致死率，將無(wú)球蟲(chóng)感染的成體隨機(jī)分為6組，分別經(jīng)口感染6000X104個(gè)/mL（An=6，早n=2）、600X104個(gè)/mL（An=7，早n=5）、60X104個(gè)/mL（An=7，早n=5）、6X104個(gè)/mL（An=6，早n=5）和0.6x104個(gè)/mL（An=7，早n=3）艾美耳混合球蟲(chóng)卵囊1mL。對(duì)照組以同樣的方法經(jīng)口灌注1mL水（An=9，早n=5）。在亞成體中，將無(wú)球蟲(chóng)感染的實(shí)驗(yàn)個(gè)體隨機(jī)分為4組，分別經(jīng)口感染600X104個(gè)/mL（An=5，早n=5）、60X104個(gè)/mL（An=5，早n=7）和6X104個(gè)/mL（An=5，早n=8）艾美耳混合球蟲(chóng)卵囊1mL，對(duì)照組個(gè)體以同樣的方法經(jīng)口灌注1mL水（An=5，早n=3）。在實(shí)驗(yàn)