綜合實(shí)驗(yàn)2：土霉素的發(fā)酵

綜合實(shí)驗(yàn)2：土霉素?fù)u瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉放線菌的微生物學(xué)特性及培養(yǎng)方法2、了解和掌握種子制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)和方法3、 了解抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律和代謝調(diào)控理論4、熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理土霉素是四環(huán)類抗生素，其在結(jié)構(gòu)上含有四并苯的基本母核，隨環(huán)上取代基的不同或位置的不同而構(gòu)成不同種類的四環(huán)素類抗生素。其結(jié)構(gòu)和命名如圖。R1R2RR1R2R3土霉素HOHCH3四環(huán)素HOHCH3金霉素ClOHCH3去甲基金霉素ClOHH多西環(huán)素HHCH3米諾環(huán)素N(CH3)2HH美他環(huán)素H=CH2OHHHHHHHHOHHHHR4 R5OH CH2(NH)CH(COOH)(CH2)4NH2土霉素具有廣譜抗菌性，能抑制多種細(xì)菌、較大的病毒及一部分原蟲。土霉素能抑制細(xì)菌的生長，在濃度高的時候也具有殺菌的作用。它的作用機(jī)制是干擾蛋白質(zhì)的合成。由于它的毒副作用小，所以其在醫(yī)療上用途廣泛，主要是應(yīng)用于呼吸道和腸道感染。土霉素是由龜裂鏈絲菌產(chǎn)生的，屬于放線菌中的鏈霉菌屬，它們具有發(fā)育良好的菌絲體，菌絲體分支，無隔膜，直徑約0.4~1.0米，長短不一，多核。菌絲體有營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲

和孢子絲之分，孢子絲再形成分生孢子。而龜裂鏈絲菌的菌落灰白色，后期生褶皺，成龜裂龜裂鏈絲菌的菌落形態(tài)顯微鏡觀察的菌絲特征狀。菌絲成樹枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。龜裂鏈絲菌的菌落形態(tài)顯微鏡觀察的菌絲特征土霉素是典型的次級代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵的特點(diǎn)之一就是分批過程分為菌體的生長期、產(chǎn)物期和菌體期三個階段。龜裂鏈絲菌的生長和土霉素的生物合成受到許多發(fā)酵條件的影響：溫度、發(fā)酵pH值、溶氧、接種量、泡沫等。同時還受到一些代謝調(diào)控機(jī)制的控制：磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用、ATP的調(diào)節(jié)和產(chǎn)生菌生長速率的調(diào)節(jié)等。三、儀器與材料（一）培養(yǎng)基1、斜面高氏一號培養(yǎng)基可溶性淀粉2%氯化鈉0.05%硝酸鉀0.1%三水磷酸氫二鉀0.05%七水硫酸鎂0.05%七水硫酸亞鐵0.001%瓊脂1.5%-2.0%pH：7.4-7.62、種子培養(yǎng)基淀粉3%黃豆餅粉0.3%硫酸銨0.4%碳酸鈣0.5%玉米漿0.4%氯化鈉0.5%磷酸二氫鉀0.015%pH：7.0-7.23、發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉15%黃豆餅粉2%硫酸銨1.4%碳酸鈣1.4%氯化鈉0.4%玉米漿0.4%磷酸二氫鉀0.01% 氯化鉆10卩g/ml 消沫劑0.01%淀粉酶0.1%-0.2%pH：7.0-7.2（二）實(shí)驗(yàn)菌種：龜裂鏈絲菌（購于廣東省微生物研究所）（三）儀器：玻璃試管、試管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（250ml,500ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫箱、臺秤等四、實(shí)驗(yàn)步驟1．斜面孢子的制備無菌條件下，從冷藏的產(chǎn)生菌的斜面孢子中，刮取適量孢子涂在高氏斜面上，然后置36.5?37°C的恒溫箱培養(yǎng)3天，再置30°C的恒溫室培養(yǎng)1天。2．種子的制備（1） 搖瓶種子培養(yǎng)基的配制按種子培養(yǎng)基成分配比，配制培養(yǎng)基，并加淀粉酶液化后，再加入CaCO3，冷卻后調(diào)pH值，分裝，包裝滅菌。（2） 接種在超凈工作臺上，將長好的斜面抱子用無菌接種鏟挖塊約2cm2，接種于滅過菌的搖瓶種子培養(yǎng)基中。（3） 培養(yǎng)將接種好的種子搖瓶于30C恒溫室搖床上，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)28小時左右。3．發(fā)酵（1） 發(fā)酵瓶培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基配方以發(fā)酵培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)題目不同而設(shè)計(jì)。搖瓶裝量依據(jù)實(shí)驗(yàn)題目而設(shè)計(jì)。制備方法同種子瓶。（2） 接種在超凈工作臺上，將培養(yǎng)28小時的搖瓶種子接種于發(fā)酵瓶中，接種量一般為10%或依據(jù)實(shí)驗(yàn)題目而設(shè)計(jì)。（3） 培養(yǎng)將接種后的發(fā)酵瓶于30C恒溫室搖床上搖6?7天，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分。（4） 發(fā)酵樣的測定：發(fā)酵液狀態(tài)觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)發(fā)酵樣品預(yù)處理：發(fā)酵瓶搖勻，將少量倒入小燒杯，測pH。用9mol/L的鹽酸溶液酸化pH至1.720攪拌10分鐘。取5ml酸化液至7ml離心管，6000轉(zhuǎn)離心4分鐘，取上清液，備測。發(fā)酵樣品土霉素效價的測定：采用分光光度法測定其效價。土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用土霉素標(biāo)準(zhǔn)樣配成1000u/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，用2ml移液管分別取標(biāo)準(zhǔn)液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml于試管中，加0.01mol/L的鹽酸共10ml,再加0.05%g/ml的三氯化鐵溶液10ml,搖勻，靜置20分鐘，另取樣同上，加0.01mol/L的鹽酸使全量為20ml，搖勻，作為空白，在480nm的波長下測定吸光度值，以土霉素效價為縱坐標(biāo)，以吸光度值為橫坐標(biāo)繪制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵液效價的測定：吸取濾液稀釋適宜倍數(shù)（使稀釋后效價在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)），用移液管取1ml稀釋液于試管中，準(zhǔn)確加入O.Olmol/L的鹽酸，使全量為10