第7章蛋白質(zhì)分離純化與表征

第7章

蛋白質(zhì)的分離純化和表征一種蛋白質(zhì)的混合物在pH6的DEAE-纖維素柱中被分離，用pH6稀鹽緩沖液可以洗脫C，用pH6的高鹽緩沖液，B和A依次被洗脫，用凝膠過(guò)濾測(cè)定得A的Mr是240000，B的Mr是120000，C的Mr是60000。但SDS只發(fā)現(xiàn)一條帶。請(qǐng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果DEAE-纖維素柱層析的結(jié)果說(shuō)明，在pH6的條件下，A帶有較多的負(fù)電荷，B次之，C帶負(fù)電荷最少。凝膠過(guò)濾法測(cè)出A的Mr是C的4倍，B的Mr是C的2倍，但SDS只發(fā)現(xiàn)一條帶。由于SDS測(cè)定的亞基的Mr，凝膠過(guò)濾法可以測(cè)定寡聚體的Mr，可以推斷C是單體，B是以C為亞基的二聚體，A是以C為亞基的4聚體，由于C在pH6時(shí)帶負(fù)電荷，隨著亞基數(shù)的增加，帶負(fù)電荷的量也會(huì)增加，這與DEAE-纖維素層析的結(jié)果也是一致的。蛋白質(zhì)分離純化是利用其特性的差異分子的大小和形狀酸堿性質(zhì)溶解度吸附性質(zhì)對(duì)配體分子的特異生物學(xué)親和力蛋白質(zhì)純化應(yīng)根據(jù)研究工作和生產(chǎn)的具體目的和要求，制訂分離純化的合理程序。

蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性

堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)

蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬(wàn)至一百萬(wàn)道爾頓之間

1道爾頓＝1×C12絕對(duì)質(zhì)量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的原理和方法（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量（二）沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（三）凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（四）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最小分子量1、測(cè)定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對(duì)分子質(zhì)量=100*55.8/鐵的百分含量例如肌紅蛋白含鐵量為0.335%，那么其最低相對(duì)分子質(zhì)量就是55.8/0.335×100=16700（二）沉降分析法

蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心作用時(shí)，由于比重的關(guān)系，蛋白質(zhì)分子就會(huì)沉降，這就是蛋白質(zhì)的沉降作用。沉降的速率與蛋白質(zhì)分子大小和密度有關(guān)，因此利用沉降速率來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。沉降系數(shù)：把物質(zhì)在單位（厘米）離心場(chǎng)的沉降速率稱(chēng)沉降系數(shù)（S）（三）凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠柱的速度并不取決于分子的質(zhì)量，而是它的斯托克半經(jīng)。如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體過(guò)柱速度相同，則認(rèn)為具有與該球體相同的半徑，稱(chēng)斯托克半徑蛋白質(zhì)混合樣標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知Mr和斯托克半徑）和待測(cè)蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球形）LogMABCLogM測(cè)V測(cè)蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)：LogM

VeVe洗脫體積，自樣品開(kāi)始洗脫到該組分的洗脫峰（峰頂）出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線(xiàn)，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可確定分子量。葡聚糖凝膠過(guò)濾法

（四）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法（最常用）蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀但是如果在該系統(tǒng)中添加SDS和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量。SDS（十二烷基硫酸鈉）一種陰離子去污劑，作為變性劑破壞分子內(nèi)的疏水作用和氫鍵。目前測(cè)定亞基分子量的最好辦法?！兜鞍踪|(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》郭堯君編著

科學(xué)出版社SDSboiling均勻帶上一層負(fù)電荷所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體有相同的荷質(zhì)比亞基構(gòu)象改變，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體為棒狀由于不同的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體具有相同的荷質(zhì)比和相同的構(gòu)象，因此遷移率不受原有的電荷、分子形狀的影響，只取決于分子量。原態(tài)蛋白質(zhì)肽鏈伸展且SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合，每克蛋白可結(jié)合1.4克SDS，相當(dāng)于每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS。棒狀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點(diǎn)：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液如：－NH3＋、－COO－、－OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當(dāng)與水接確時(shí)，極易吸附水分子，使蛋白質(zhì)顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開(kāi)，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。

蛋白質(zhì)的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因：

１、蛋白質(zhì)多肽鏈上含有許多極性基團(tuán)。2、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在非等電狀態(tài)時(shí)，相同蛋白質(zhì)顆粒帶有同性電荷，與周?chē)姆措x子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。

+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層與雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對(duì)穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。透析法：以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透析法半透膜：只允許溶劑小分子通過(guò)，而溶質(zhì)大分子不能通過(guò)，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等如果破壞這兩個(gè)因素，蛋白質(zhì)溶液會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的沉淀

Pr從膠體溶液中析出任何破壞穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素都可能使蛋白質(zhì)沉淀I可逆沉淀溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒(méi)有變化適當(dāng)條件下可重新溶解——非變性沉淀可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。不可逆沉淀強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ1.

鹽析

在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。

而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱(chēng)為鹽溶。鹽析的機(jī)理：

破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。如：微生物發(fā)酵酶制劑各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分散沉淀析出，這種方法稱(chēng)為分段鹽析。等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶2.

有機(jī)溶劑沉淀法：

在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理：

破壞蛋白質(zhì)的水化膜以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用。注意：有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。3.弱酸或弱堿沉淀法(等電點(diǎn)沉淀）

用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理：

破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷，蛋白質(zhì)分子帶有相同數(shù)量的正負(fù)電荷，因此，蛋白質(zhì)分子相互吸引，從而聚集沉淀。酸酸堿堿堿酸溶液中蛋白質(zhì)的聚沉4.重金屬鹽沉淀(條件：pH稍大于pI為宜)

當(dāng)pH稍大于pI時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷這樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。

例如：“牛奶解毒，汞消毒”5.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）

生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類(lèi)含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱(chēng)為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。

生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理：

在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。

例如：“柿石癥，啤酒澄清”6.加熱變性沉淀法

幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速.如：煮雞蛋酶的制備：超氧化物歧化酶的提取原因：天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.前處理：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異2.粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶是最后步驟五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1、透析和超過(guò)濾利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜將其與小分子物質(zhì)分開(kāi)半透膜為玻璃紙或纖維素材料血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液加壓血液2、密度梯度（區(qū)帶）離心用一定的介質(zhì)（如蔗糖）在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將蛋白質(zhì)混合液置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使蛋白質(zhì)分層、分離。3、凝膠過(guò)濾3.凝膠過(guò)濾（二）利用溶解度差