高中生物核心概念高考復習課件-蛋白質提取和分離

2023/9/18蛋白質的提取和分離能從成千上萬種蛋白質混合物中純化出一種蛋白質的原因是不同蛋白質在許多理化性質上有著極大的不同。這些理化性質的不同是由于氨基酸的數(shù)目和序列不同造成的。蛋白分離的方法基本知識與蛋白質分離相關的理化特性分子大小分子形狀帶電特性溶解特性與配體特異性結合不同吸附性質變性和復性基本知識分子大小大小蛋白質的分子大小主要取決于蛋白質肽鏈的數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。幾百—百萬Da常用方法透析超濾凝膠過濾離心基本知識透析法基本知識超過濾基本知識分子形狀形狀形狀的不同會導致蛋白質在離心通過溶液時，或通過膜、凝膠過濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運動時，都會受到它的形狀的影響。方法梯度離心的影響電泳的影響基本知識電荷原理蛋白質的凈電荷取決于氨基酸殘基所帶正、負電荷總和。若天冬氨酸和谷氨酸占優(yōu)勢，在pH7.0時帶凈負電荷，稱為酸性蛋白質。若賴氨酸和精氨酸占優(yōu)勢，在pH7.0時帶凈正電荷，稱為堿性蛋白質。方法電泳離子交換層析基本知識溶解度原理由于蛋白質分子表面親水性和疏水性帶電基團不同，因此在溶劑中的溶解度不同。方法：通過改變pH、離子強度或加入有機試劑，促進蛋白質分子的凝聚進而形成沉淀。沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法基本知識配體特異性結合原理生物大分子的某些特定結構能夠同其他分子相互識別并結合，這種結合是特異的又是可逆的，生物分子間的這種結合能力稱為親和力。方法將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對另一個分子進行分離純化?；局R變性和復性原理蛋白質在一定的理化條件下會失去原有的空間結構、生物學功能及部分理化特性等稱為變性。當變性條件去除后恢復原有的空間結構及生物學功能即為復性。方法尿素變性復性從包涵體中純化原核表達蛋白基本知識提取分離原則盡可能多地提取目的蛋白，同時避免因熱、pH或有機試劑、金屬離子、蛋白酶等因素造成活性丟失。選擇合適的pH、選擇合適的離子強度選擇合適的比例蛋白質的提取提取液成分的確定pH緩沖液：Tris-HCl,Tris-Gly,Gly-HCl,檸檬酸-檸檬酸鈉離子強度：動物NaCl,植物KCl還原劑:2-巰基乙醇蛋白酶抑制劑：EDTA,PMSF,TPCK,TLCK金屬離子螯合劑:EDTA,EGTA溫度0-4℃蛋白質的提取常用的實驗技術：凝膠色譜法和電泳蛋白質的分離凝膠色譜法原理以多孔性凝膠材料為支持物，當?shù)鞍踪|溶液流經此支持物時，分子大小不同的蛋白質所受到的阻滯作用不同而先后流出，從而達到分離純化的目的。凝膠介質葡聚糖（glucose）瓊脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）蛋白質的分離凝膠色譜法電泳（Electrophoresis

）電泳就是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動。蛋白質的分離蛋白質常用電泳技術聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）蛋白質的分離1、由于SDS是陰離子，使多肽表面覆蓋的負電荷遠遠超過蛋白質分子原有的電荷量，消除了原來的電荷差異，分子量大小與遷移率成正比。2、改變了蛋白質單體分子的構象，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都相同，長軸長度隨其分子量的大小成正比變化。蛋白質的分離目標理解色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理了解緩沖液的組成及其作用血紅蛋白的分離－樣品處理重點凝膠色譜法的原理難點電泳法分離大分子的原理血紅蛋白的提取和分離凝膠色譜法原理：當不同的蛋白質通過凝膠時，相對（）的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質量不同的蛋白質因此得以分離。分子質量較小較長較慢相對分子質量較大凝膠外部較短較快血紅蛋白的提取和分離凝膠色譜法分離蛋白質過程血紅蛋白的提取和分離概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液：作用：能夠抵制（）的對溶液的（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值血紅蛋白的提取和分離緩沖溶液的配制通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內1.樣品血液血漿水分固體物質血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（）兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈共四條肽鏈90％每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色。血紅蛋白的提取和分離樣品處理—粗分離—純化—純度鑒定蛋白質的提取和分離一般分為四步：實驗操作血紅蛋白的提取和分離(1)紅細胞的洗滌:

去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。（一）樣品處理①洗滌目的:②洗滌操作：1、采集血樣。注意要加入檸檬酸鈉防止血液凝固。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數(shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。血紅蛋白的提取和分離(：2)血紅蛋白的釋放加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以

2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。血紅蛋白的提取和分離分離血紅蛋白溶液有機溶劑無色透明的甲苯層脂類物質白色薄層固體（脂溶性物質沉淀層）血紅蛋白溶液紅色透明液體紅細胞破碎物沉淀暗紅色沉淀物血紅蛋白的提取和分離（二）、血紅蛋白的粗分離透析：①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/l的

磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質。原理：透析袋能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內。血紅蛋白的提取和分離透析過程血紅蛋白的提取和分離凝膠色譜操作

（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。血紅蛋白的提取和分離（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。血紅蛋白的提取和分離注意：2、裝填凝膠柱時不得氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙血紅蛋白的提取和分離④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時，使凝膠裝填緊密。

注意：液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離(視頻)（3）樣品加入與洗脫①調節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝