結(jié)核分枝桿菌γ

結(jié)核分枝桿菌7?干擾素體外釋放試驗(TB-IGRA)對結(jié)核性胸腔積液的診斷價值【摘要】目的探討結(jié)核分枝桿菌(MTB)Y-干擾素體外釋放試驗(TB-IGRA)在疑似MTB感染體胸腔積液患者快速診斷中的應(yīng)用價值。方法疑似MTB感染伴胸腔積液患者138例，應(yīng)用TB-IGRA定量檢測外周血淋巴細胞分泌Y-干擾素的水平。利用MTBDNA法檢測胸腔積液中的MTB，同時用免疫金標法檢測血清MTB抗體，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果138例疑似患者經(jīng)過痰和胸腹水抗酸染色鏡檢，痰液和胸腹水MTB培養(yǎng)，結(jié)核菌素皮膚試驗，MTBDNA和MTB抗體等試驗確診結(jié)核病患者48例，陽性檢出率34.8%，TB-IGRA的陽性檢出率為32.6%，MTBDNA的陽性檢出率為13.8%，血清MTB抗體的陽性檢出率為10.1%。對已確診的48例結(jié)核病患者進行數(shù)據(jù)分析，TB-IGRA，MTBDNA和血清MTB抗體的準確率分別為93.8%，39.6%，29.1%。據(jù)統(tǒng)計分析可知，TB-IGRA的陽性檢出率和準確率均顯著高于其他2種方法(P<0.05)。TB-IGRA對疑似MTB感染的胸腔積液患者診斷的陽性預(yù)測值為93.3%，陰性預(yù)測值為93.6%。結(jié)論TB-IGRA對疑似MTB感染伴胸腔積液患者的診斷具有快速，高敏感性高特異性的優(yōu)點，優(yōu)于MTBDNA和血清MTB抗體試驗，可以作一種新的技術(shù)用于人體MTB感染的診斷。【關(guān)鍵詞】y-干擾素釋放試驗；結(jié)核分枝桿菌；DNA；抗體；胸腔積液EvaluationofthevalueofTB-IGRAtestinmycobacteriumtuberculosisinfectofpatientswithpleuraleffusion[AbstraetJobjectiveToinvestigatetheapplicationsignificanceofmycobacteriumtuberculosisIFN-rreleaseassay(TB-IGRA)intherapiddiagnosisforsuspectedMTBinfectedpatientswithpleuraleffusion.MethodsThe138patientswithpleuraleffusionwhichweresuspectedashavingsuspectedMTBinfectionwereenrolled.TB-IGRAwasusedtodeterminethelevelofIFN-rofperipheralbloodlymphocyte.TheMTBDNAmethodwastodetectMTBinpleuraleffusion,meanwhileserumanti-MTBantibobywasdetectedbyimmunogoldfiltrationassay,andtheresultswerediagnosedastuberculosisbysputum,pleuraleffusionandascitessmeartest,sputum,pleuraleffusionandascitesMTBculture,tuberculinskintest,MTBDNAmethodandanti-MTBantibodytest,andthepositiveratewas34.8%.ThepositivetypeofTB-IGRAinthe138patientswithpleuraleffusionwas32.6%,ThepositiverateofMTBDNAmethodwas13.8%,andthepositiverafeofanti-MTBantibodytestwas10.1%.Thedateof48patientswithtuberculosiswereanalyzed.TB-IGRAhadtheconsistencyrateof93.8%,whiletheconsistencyratesofMTBDNAmethodandanti-MTBantibodytestwere39.6%and29.1%respectively.ThepositiverateandconsistencyrateofTB-IGRAweresignificantlyhigherthanthoseoftheothers(p<0.05).ThepositiveandnegativepredictivevaluesofTB-TGRAinsuspectedMTBinfectedpatientswithpleuraleffusionwere93.3%and93.6%respectively.ConclusionsTB-IGRAisfast,hipersensitivityandhighspecificitytodiagnosethesuspectedMTBinfectedpatientswithpleuraleffusion.TB-IGRAisbetterthanMTBDNAmethodandanti-MTBantibodytest.TB-IGRAcanbecomeanewdiagnoticmethodtobeappliedinthediagnosisofMTBinfection.［keywords］interferon-gammareleaseassay(IGRA);Mycobacteriumtuberculosis(MTB);DNA;Antibody;pleuraleffusion結(jié)核病是世界上單一致病菌引起的死亡最多的疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2011年全球約有870萬例新發(fā)結(jié)核病患者，而死于此病的人數(shù)達140萬［1］。結(jié)核性胸膜炎是一種僅次于淋巴結(jié)核的常見肺外結(jié)核病，臨床表現(xiàn)為胸膜性疾病和干咳及單側(cè)少至中等胸腔積液⑵。目前，結(jié)核性胸膜炎診斷準確性較低，結(jié)核胸腔積液中找結(jié)核分枝桿菌是目前確診結(jié)核性胸膜炎的重要依據(jù)，但涂片陽性率極低，僅為0~25%，而胸腔積液的細菌培養(yǎng)陽性率低，且時間長，難以及時報告臨床治療，診斷金標準的胸膜活檢陽性率僅為62.2%~69.7%［3,4］。但其為有創(chuàng)檢查，患者依從性差，檢查費用高，不符合常規(guī)應(yīng)用。因此，尋找一種無創(chuàng)，快速和準確的胸腔積液診斷方法成為提高結(jié)核性胸膜炎診斷水平的關(guān)鍵。近年來，國外有關(guān)研究證實［5,6］，結(jié)核分枝桿菌相關(guān)Y-干擾素體外釋放試驗(tuberculosisinterferon-rreleaseassays)TB-IGRA對檢測結(jié)核分枝桿菌的感染具有較好的特異度和敏感度。由于胸水中免疫反應(yīng)的強度比血液中更高，因此，通過檢測胸水中的Y—干擾素釋放水平來診斷活動性胸膜結(jié)核被證實是有意義的。本研究通過對與結(jié)核感染相關(guān)性的胸腔積液進行TB-IGRA試驗，MTBDNA和MTB抗體檢測，探討TB-IGRA在明確胸腔積液中結(jié)核診斷中應(yīng)用價值。1材料和方法1.1研究對象選擇2013年4月至2015年2月因患有胸腔積液而在惠山區(qū)人民醫(yī)院相關(guān)科室住院的患者，入選標準：咳嗽，呼吸困難，急促，胸敞片和計算機斷層掃描檢查提示伴有中等量以上的胸腔積液的患者。排除標準;(1)入院前，實施抗結(jié)核治療＞1星期者；(2)合并糖尿病以及其它嚴重的肝功能、腎功能異?；蚬δ懿蝗颊?；(3)人類免疫缺陷病毒陽性者。根據(jù)上述標準共入選患者138例，其中男88例，女50例，中位年齡56.8(29-73)歲，均符合2008年8月1日宣布的中華人民共和國衛(wèi)生部頒發(fā)的中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準。1.2儀器和試劑MutiskanMKs型酶標儀購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司，北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司的分枝桿菌r-干擾素釋放試驗檢測試劑盒(TB-IGRA試劑)，MTBDNA檢測試劑盒由廣東達安基因有限公司提供，PCR擴增儀與美國ABI公司Tn7300實時熒光定量PCR儀。上海奧普生物制藥公司生產(chǎn)的MTB抗體膠體金法診斷試劑盒1.3方法1.3.1TB-IGRA試劑試驗步驟BD肝素鋰抗凝管采血等抽?。?ml靜脈血，馬上輕柔顛倒混勻3次以上，把全血分裝到3個不同的培養(yǎng)管中(T測試管，N本底對照管，P陽性對照管等)，等分裝1ml，分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管5次，于37°C培養(yǎng)管中靜置培養(yǎng)22+-2h，培養(yǎng)完成后，留取收集上清液，然后用雙抗體夾心法定量檢測上清液中的IFN-r的含量，T管中有特異性開高的IFN-r的量，來測定為結(jié)核感染陽性。1.3.2MTBDNA檢測，胸腔積液沉渣抽提MTBDNA，檢測試劑盒由廣東達安基因有限公司提供。聯(lián)合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)擴增儀為美國MBI公司的7300實時熒光定量PCR儀，嚴格按標準操作程序進行。1.3.3血清MTB抗體檢測檢測所用試劑為上海奧普生物醫(yī)藥公司提供的MTB抗體膠體金法診斷試劑盒，實驗原理為斑點免疫金滲濾法，嚴格按說明書操作。1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用spss16.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩種方法的陽性率比較采用X2檢驗，以p<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果138例疑似MTB感染的胸腔積液患者TB-IGRA和MTBDNA檢測陽性率和準確率比較138例疑似MTB感染的胸腔積液患者用TB-IGRA和MTBDNA檢測，兩者同時陽性13例，TB-IGRA陽性而MTBDNA陰性陰性32例，MTBDNA陽性而TB-IGRA陰性6例，TB-IGRA的陽性檢出率為32.6%，MTBDNA的陽性檢出率為13.8%，兩種方法的陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=11.6,P<0.05)見表1表1138例疑似MTB感染的胸腔積液患者TB-IGRA和MTBDNA檢測陽性率比較TB-IGRAMTBDNA合計陽性陰性陽性133245陰性68793合計1911913848例確診MTB感染的胸腔積液患者用TB-IGRA和MTBDNA檢測，兩者同時陽性8例，TB-IGRA陽性而MTBDNA陰性34例，MTBDNA陽性而TB-IGRA陰性4例，TB-IGRA的準確率87.5%,MTBDNA的準確率為25%，兩種方法的準確率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=5.84，P<0.05)見表2表248例MTB確診MTB感染用TB-IGRA和MTBDNA檢測準確率比較TB-IGRAMTBDNA合計陽性陰性陽性83442陰性426合計123648138例疑似MTB感染的胸腔積液患者TB-IGRA和MTB抗體的陽性率，不準確度比較。138例疑似MTB感染的胸腔積液患者用TB-IGRA和MTB抗體檢測，兩者同時陽性9例，TB-IGRA陽性而MTB抗體陰性36例，MTB抗體陽性而TB-IGRA陰性5例，TB-IGRA的陽性檢出率32.6%，MTB抗體陽性檢出率10.1%,兩種方法陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=21.2，P<0.05)見表3表3138例疑似MTB感染的胸腔積液患者TB-IGRA和MTB抗體陽性率比較

陽性陰性陽性93645陰性58893合計14124138TB-IGRAMTB抗體合計48例確診MTB感染的胸腔積液患者用TB-IGRA和MTB抗體檢測，兩者同時陽性6例，TB-IGRA陽性而MTB抗體陰性3例，MTB抗體陽性而TB-IGRA陰性3例，TB-IGRA的準確率為87.5%，MTB抗體的準確率為18.75%，兩種方法的準確率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（X2=4.827，P<0.05），見表4表448例確診MTB感染的胸腔積液TB-IGRA和MTB抗體檢測的準確率比較TB-IGRAMTB抗體合計陽性陰性陽性63642陰性336合計93948138例疑似MTB感染的胸腔積液患者TB-IGRA,MTBDNA,MTB抗體檢測結(jié)果比較計算TB-IGRA,MTBDNA,MTB-Ab的敏感性，特異性，陽性預(yù)測值以及陰性預(yù)測值，可以看出TB-IGRA對診斷結(jié)核性胸腔積液敏感性，特異性，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值最高。見表5表5138例疑似MTB感染的胸腔積液患者TB-IGRA，MTBDNA,MTB抗體檢測結(jié)果比較檢測方法陽性陰性敏感性％特異性％陽性預(yù)測值％陰性預(yù)測值％TB-IGRA459387.5(42/48)96.7(8於0)93.3(4跑5)93.6(8於3)MTBDNA1911925.0(1跑8)93.3(84/90)63.2(12/19)70.6(84/119)MTB抗體1412418.8(9/48)95.6(86/90)64.3(9/14)69.4(86/124)3討論結(jié)核病是一種常見且難以進行病原學(xué)診斷的疾病，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害人體健康，結(jié)核病的實驗室診斷是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，是確定結(jié)核病診斷的治療方案和重要依據(jù)，也是考核療效評價效果的重要參考。雖然目前診斷結(jié)核病的方法較多，如結(jié)核菌素純蛋白衍生物（PPO）皮試，血清結(jié)核抗體（TB-Ab），胸腔積液TB-DNA等，但每種檢測方法的靈敏度和特異度均不太理想，盡管從結(jié)核性胸腔積液中培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌是金標準，雖可提高診斷率，但耗時較長（一般需培養(yǎng)6-8周），作為早期診斷的意義不大。現(xiàn)臨床上常用診斷結(jié)核性疾病的方法有PPD皮試和血清結(jié)核抗體（TB-Ab）檢測，PPD作為結(jié)核感染應(yīng)用最普遍的篩查工具，存在假陽性高，特異性低的局限性⑺。PPD在免疫力低下的人群中，其靈敏度下降【8.9］°MTB感染后機體主要的免疫反應(yīng)為T細胞免疫，其血清抗體檢測意義也不大［10］。近年來，PCR熒光探針檢測結(jié)核分枝桿菌DNA（TB-DNA）也應(yīng)用于結(jié)核性疾病的診斷，其具有較好的靈敏度及特異性。Trajman等口】研究報道指出，胸腔積液TB-DNA在結(jié)核性胸膜炎中診斷敏感性為35%~82%，特異性為85.4%~100%，Smach等[12]報道TB-DNA診斷敏感性為24%~60%，特異性為80%~100%，本文胸腔積液TB-DNA診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性為25.0%特異性為93.3%，與以上報道大致相符。隨著科技發(fā)展，近年來發(fā)展起來的以T細胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的IFN-r釋放試驗(interferongammareleaseassays,IGRA)被廣泛應(yīng)用于歐美國家的各級醫(yī)療機構(gòu)列入結(jié)核病診療指南，TB-IGRA作為一項新的診斷技術(shù)[13]，主要用于檢測結(jié)核菌潛伏感染，此外該實驗還被用于活動性肺結(jié)核的診斷，預(yù)測和鑒別診斷。本文闡明了IGRA檢測胸水中的T細胞反應(yīng)以檢測結(jié)核分枝桿菌感染的試驗取得了較好的效果。IGRA采用兩種結(jié)核特異性蛋白：早期分泌抗原靶蛋白(earlysecretingantigenictarget,ESAT-6)和培養(yǎng)濾出蛋白(culturefiltrateprotein,CFP10)，刺激夕卜周血中特異性T淋巴細胞分泌IFN-r,于37°C體外培養(yǎng)20-23h后，通過雙抗體夾心法定量檢測培養(yǎng)液中IFN-r的含量，以反映體內(nèi)結(jié)核特異性Th細胞的水平，這個顯著的優(yōu)異性使得r-干擾素釋放試驗得以應(yīng)用于臨床。本文研究表明TB-IGRA對結(jié)核性胸腔積液的診斷具有較高特異性和敏感性，分別為96.7%和87.5%，與國外報道符合【14]同時將TB-IGRA與TB-DNA;TB-Ab進行比較，其陽性率分別為93.8%，39.6%和29.1%，可見，TB-IGRA檢測陽性率明顯高于其他方法，可以肯定TB-IGRA對診斷結(jié)核性胸腔積液是較為敏感的項目。綜上所述，TB-IGRA作為體外實驗，所用抗體特異性高，且不受卡介苗等其他致病性非結(jié)核分枝桿菌的干擾，具有檢測安全方便，快速等優(yōu)點，可作為結(jié)核分枝桿菌感染的常規(guī)診斷方法，在結(jié)核病的臨床診斷中具有良好的應(yīng)用價值，但三者聯(lián)合檢測能提高對結(jié)核的準確診斷。參考文獻【1】GlaziouP,FalzonD,FloydK,etal.Globalepidemiologyoftuberculosis[J].SeminRespirCritCareMed,2013,34(1):3-16.【2】楊儀，李向炯，翁家豪.不同年齡組結(jié)核性胸膜炎的臨床特征[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2013,11(8)：1235-1236.【3】SakuraraM,MasudaK,HebisawaA,etal.Thoracoscopicpleuralbiopsyfortuberculouspleurisyunderlocalanesthesia[J].AnnThoracCardiovaseSurg,2006,12(4):245-248.【4】GopiA,MadhavenSM,ShannaSK,etal.Diagnosisandtreatmentoftuberculouspleuraleffusionin2006[J].Chest,2007,31(3):880-889.【5】DielR,LoddenkempeirR,NienhausA.Evidence-basedcomparisonofcommercialinterferon-rreleaseassaysfordetecingactiveTB:ametaanalysis[J].Chest,2010,137(4):952-968.【6】DielR,LoddenkemperR,Meywald-WalterK,etal.PredictivevalueofawholebloodIFN-gammaassayforthedevelopmentofactivetuberculosisdiseaseafterrecentinfectionwithMycobacteriumtuberculosis[J].AmJRespirCritCareMed,2008,177(10):1164-1170.【7】張立華，靳文香，賈紅彥，等。T-SPOT與結(jié)核菌素試驗對結(jié)核病患者的臨床診斷價值[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2012,6(14)：4107-4108.【8】OzekinciT,OzbekE,CelikY.ComparisonoftuberculinskintestandaspecificT-cellbasedtest,T-Spot.TBforthediagnosisoflatenttuberculosisinfection[J].JIntMedRes,2007,35(5):696-703.【9】KimSH,SongKH,C