原核表達(dá)的詳細(xì)步驟

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原核表達(dá)詳細(xì)步驟原核表達(dá)的詳細(xì)步驟最新文檔(可以直接使用，可編輯最新文檔，歡迎下載）PartⅠ選擇表達(dá)的目的基因一、基因序列

1.得到靶基因DNA（cDNA）序列，有幾種方式尋找正確的讀碼順序:

①

利用生物信息學(xué)在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正確的讀碼。

②

實(shí)驗(yàn)方法，即得到蛋白，進(jìn)行測(cè)序，然后在DNA上找到正確的讀碼。

③

利用mRNA的特征，找到啟動(dòng)子，編碼區(qū)，終止子。在編碼區(qū)中找到翻譯起始密碼子與終止密碼子（cDNA）。

2.注意事項(xiàng)：

①區(qū)別ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定義，尋找原則是翻譯起始密碼子和終止密碼子；CDS可以是DNA上的定義，也可以是mRNA上的定義，分為completeCDS和partialCDS,是從第一個(gè)核酸開始讀，連續(xù)讀下去，completeCDS讀碼是“M、、、、、、、、、＊”，partialCDS的讀碼是相應(yīng)的AA

②在進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，充分利用生物信息學(xué)的信息后，在進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

二、抗原決定簇的預(yù)測(cè)1、

原理：

蛋白質(zhì)表面部分可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的區(qū)域叫抗原決定簇。一般抗原決定簇是由6－12氨基酸或碳水基團(tuán)組成，它可以是由連續(xù)序列（蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成。變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物，用來免疫動(dòng)物具有更強(qiáng)的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會(huì)暴露出來，如果用該變性抗原制備的抗體來檢測(cè)變性抗原是可以的，如果用來檢測(cè)天然蛋白，可能會(huì)有假陽性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對(duì)抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還要看將來該單抗用來干什么。

2、

選擇原則：

（1）、親水性：大部分抗原決定簇是親水性的。

（2）、處于結(jié)構(gòu)表面：大部分抗體只與蛋白質(zhì)表面部分結(jié)合。

（3）、有彈性：許多已知的抗原決定簇是在自由活動(dòng)區(qū)域。所以一般來說蛋白質(zhì)的N端及C端是很好的抗原決定簇區(qū)域。

3、選定抗原決定簇的步驟：（1）預(yù)測(cè)：如軟件預(yù)測(cè)DNAstar（Protean）預(yù)測(cè)，Dnaman。在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)（and

）

（2）選定：接近N、C端；選取在此區(qū)間內(nèi)，（AntigenicIndex）Jameson-wolf抗原決定簇選正分高處；（Hydrophilicityplot）Kyte-Doolittle預(yù)測(cè)親水性強(qiáng)的區(qū)域。同時(shí)符合以上3點(diǎn)的區(qū)域較好（命名為多肽片斷A）。

注：如果設(shè)計(jì)的多肽是跨膜蛋白，請(qǐng)盡量回避選擇蛋白的跨膜區(qū)，即頭端信號(hào)肽所在的區(qū)域

（3）NCBI（BlastP）比對(duì)：將多肽片斷A放入blastp進(jìn)行同源性比對(duì)。如果制備某一動(dòng)物種屬的抗體，該區(qū)必須與該動(dòng)物的氨基酸序列沒有較高的同源性。

注：這一步往往容易漏掉，所以學(xué)會(huì)應(yīng)用生物信息學(xué)，可以減少走彎路?。?！

（4）抗原合成：

①原核表達(dá)：

②化學(xué)合成：需要做化學(xué)偶聯(lián)增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性。多肽的純度越純?cè)胶茫话?gt;80%就完全可以了。合成5-10mg就可以了。PartⅡ選擇表達(dá)系統(tǒng)一、選擇表達(dá)載體

1、選擇表達(dá)載體的原則

（1）蛋白質(zhì)大?。簺Q定在胞質(zhì)中表達(dá)還是以包涵體的形式表達(dá)，是否加標(biāo)簽或以融合蛋白的形式表達(dá)。

（2）蛋白需求量：根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案確定蛋白需求量，選擇合適的載體。

（3）蛋白質(zhì)是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表達(dá)（胞質(zhì)蛋白），無活性的不溶的蛋白（包涵體蛋白）

2、原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：

（1）選擇標(biāo)志的編碼序列：用于篩選重組子，有抗生素抗性基因、報(bào)告基因（GFP等）

（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子：

啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對(duì)表達(dá)量有決定影響的因素之一。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)。

原核啟動(dòng)子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對(duì)mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5～10bp處，有一段由6～8個(gè)堿基組成，富含A和T的區(qū)域，稱為Pribnow盒，又名TATA盒或－10區(qū)。來源不同的啟動(dòng)子，Pribnow盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35bp處，有一段由10bp組成的區(qū)域，稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時(shí)大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子。-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結(jié)合，-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn)，形成新生的RNA鏈。

原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動(dòng)子有Lac(乳糖啟動(dòng)子)、Trp(色氨酸啟動(dòng)子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)、lPL(l噬菌體的左向啟動(dòng)子)、T7噬菌體啟動(dòng)子等。

（3）轉(zhuǎn)錄終止子：

在一個(gè)基因的3¢末端或是一個(gè)操縱子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉(zhuǎn)錄功能，這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子，簡(jiǎn)稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號(hào)上，完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對(duì)RNA聚合酶起強(qiáng)終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且有與A/T富含區(qū)對(duì)應(yīng)的一串U。轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制較為復(fù)雜，并且結(jié)論尚不統(tǒng)一。但在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點(diǎn)的下游插入一段很強(qiáng)的rrB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。

（4）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）：

1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10bp處的由3～9bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16SrRNA3¢末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn)。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡(jiǎn)稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會(huì)影響mRNA與核糖體的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外，真核基因的第二個(gè)密碼子必須緊接在ATG之后，才能產(chǎn)生一個(gè)完整的蛋白質(zhì)。

（5）多克隆位點(diǎn)（MCS）：選擇的酶切位點(diǎn)在靶基因上沒有相應(yīng)的酶切序列，否則在構(gòu)建重組子進(jìn)行酶切時(shí)會(huì)把靶基因給切開。在惠贈(zèng)或交換的質(zhì)粒中確定MCS的正確性，否則會(huì)造成錯(cuò)讀密碼子。

（6）復(fù)制子：通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子（復(fù)制起始部位）的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān)，當(dāng)然也不是越多越好，超過細(xì)胞的承受范圍反而會(huì)損害細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果碰巧需要2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元（？）是否相容的問題。

（7）融合Tag：基因融合是將兩個(gè)或多個(gè)開放閱讀框按一定順序連接起來，并且正確讀碼。在表達(dá)靶蛋白是加上融合標(biāo)簽的好處，（a保護(hù)靶蛋白免受原核宿主蛋白酶的降解；b提供親和純化的配基結(jié)合位點(diǎn)；c改善靶蛋白的溶解性，使其正確折疊；d與已知酶或抗原結(jié)構(gòu)域連接，可以進(jìn)行標(biāo)記和分離；e與信號(hào)肽連接，可將融合蛋白分泌到特定細(xì)胞區(qū)域。）

注：選擇融合蛋白表達(dá)載體時(shí)，融合標(biāo)簽與靶蛋白的連接處如果有酶切位點(diǎn)，且想除去標(biāo)簽，則載體的酶切序列在靶蛋白中不能出現(xiàn)。

二、選擇表達(dá)宿主

首先要看靶基因中有沒有細(xì)菌不常用的密碼子——如果有，需要考慮換表達(dá)菌株。每種菌株都有自己獨(dú)特的設(shè)計(jì)，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細(xì)菌中存在更穩(wěn)定，表達(dá)的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在細(xì)菌中的菌株才可用于表達(dá)。采用不同調(diào)控機(jī)制會(huì)使用不同的表達(dá)菌株，所以換菌株一定要仔細(xì)看過載體的調(diào)控方式再換。以Novagen為例，如果使用BL21(DE3)表達(dá)不成功的話可以換Rosetta系列菌株，它能夠由一種氯霉素抗性的、與pET相容的質(zhì)粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達(dá)限制。有時(shí)不明原因的表達(dá)蛋白截短（比預(yù)期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密碼子造成的。另外一種可能是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋镜妆磉_(dá)產(chǎn)物抑制。1.

原核表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌）

優(yōu)點(diǎn)：①遺傳圖譜明確②容易培養(yǎng)且費(fèi)用低③對(duì)許多外源蛋白耐受能力強(qiáng)④能高水平表達(dá)這些蛋白

缺點(diǎn)：①蛋白質(zhì)不能進(jìn)行翻譯后修飾（在真核高爾基復(fù)合體中的糖基化修飾，特點(diǎn)位點(diǎn)的切割等產(chǎn)生具有活性的蛋白）②具有密碼子的偏好（？）

2.

真核表達(dá)系統(tǒng)

優(yōu)點(diǎn)：可以產(chǎn)生修飾的蛋白

缺點(diǎn)：①真核表達(dá)系統(tǒng)復(fù)雜②費(fèi)用高

注：不同的表達(dá)宿主有相應(yīng)的表達(dá)載體，二者應(yīng)是最佳表達(dá)組合。PartⅢ構(gòu)建重組子一、重組子的構(gòu)建

1.設(shè)計(jì)引物：a保證引物序列擴(kuò)出的靶基因插入到表達(dá)載體MCS上，能夠正確讀碼；b引物兩端加入酶切位點(diǎn)；c遵循引物設(shè)計(jì)原則（一般性引物自動(dòng)搜索可采用“PremierPrimer5”軟件，而引物的評(píng)價(jià)分析則可采用“Oligo6”軟件）。

2.

擴(kuò)增靶基因：

（1）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)

獲得所需基因片段。

（2）通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行

PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

注：但在PCR過程中，需要減少突變的發(fā)生，可采用高保真酶，盡量減少PCR循環(huán)次數(shù)，增加模板和引物的濃度。尤其注意不要引入終止

密碼子。

3.

限制性內(nèi)切核酸酶消化載體DNA和目的基因：

（1）載體雙酶切后回收：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。（減少假陽性的重組質(zhì)粒連接，去除切下的小片段多克隆位點(diǎn)）

（2）PCR產(chǎn)物雙酶切后回收：限制性消化和膠純化是制備插入片段的常規(guī)方法。一般先用PCR擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因，克隆進(jìn)T－載體，然后用與消化載體相同的內(nèi)切酶進(jìn)行消化和膠回收。

注：雙酶切后，進(jìn)行回收純化，可以提高陽性克隆的幾率。

4.連接目的基因和載體

二、重組子的驗(yàn)證

1.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌（感受肽的制備，轉(zhuǎn)化）

2.鑒定帶有重組質(zhì)?？寺。撼Ｓ梅椒ǖ挠笑?互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、PCR以及雜交篩選。如果亞克隆成功，陽性菌落數(shù)遠(yuǎn)大于陰性菌落（甚至全部為重組子）。

3.篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，DNA序列測(cè)定。（正確測(cè)序）

測(cè)序結(jié)果出來后，首先，看看載體的多克隆位點(diǎn)和片斷插入的序列，是否有因?yàn)槊盖羞B接而意外引入了轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，讀碼是否正確，這是最有說服力的鑒定結(jié)果。有時(shí)載體幾經(jīng)多個(gè)實(shí)驗(yàn)人員的周轉(zhuǎn)，反復(fù)插入片斷，或者是粘端相同的不同酶切片斷之間的連接，會(huì)意外在啟動(dòng)子后面帶入終止位點(diǎn)，特別是用到XbaI之類的酶要小心。

然后要對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行確定，確定插入的每個(gè)堿基都是正確的，沒有意外終止的情況。

注：長(zhǎng)期保存的重組子在高濃度甘油（19％）中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定，即脫質(zhì)粒?？梢詫⑤d體和宿主分別保存。PartⅣ誘導(dǎo)表達(dá)一、誘導(dǎo)表達(dá)1.

誘導(dǎo)表達(dá)類型組成型表達(dá)：表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，成本低，但是不適合表達(dá)一些對(duì)宿主細(xì)菌生長(zhǎng)有害的蛋白。因?yàn)檫^量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，反過來影響表達(dá)量的積累。

誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)：表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長(zhǎng)前期高表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，又可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。另外也有啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

融合表達(dá)：表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測(cè)。對(duì)于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小Tag以減少對(duì)目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。

分泌表達(dá)：在起始密碼和目的基因之間加入信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，或者形成包含體，而且表達(dá)產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間。

可溶性表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動(dòng)子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高（非常股復(fù)雜）。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。

2.誘導(dǎo)表達(dá)（1）挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。

（2）按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大約需3h。

（3）取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入100mMIPTG至終濃度為0.4mM（T7啟動(dòng)子）或1mM（T7lac啟動(dòng)子），作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)

37℃震蕩培養(yǎng)3h。

（4）分別取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀，用PBS重懸、洗滌、離心。

（5）對(duì)細(xì)菌沉淀進(jìn)行處理，做SDS等分析。

3.注意事項(xiàng)：

（1）關(guān)于表達(dá)不出來的原因有很多

a如果測(cè)序都是正確的話，設(shè)計(jì)一個(gè)postiveexpressioncontrol，驗(yàn)證整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)沒問題。

b檢測(cè)是否有毒性。涂一個(gè)IPTG的板子看菌落生長(zhǎng)情況如何。

c看看稀有密碼子情況，是不是存在成簇的N端的稀有密碼子。

d看看穩(wěn)定性，上swissprot看看在大腸桿菌中的穩(wěn)定時(shí)間是多少。

e如果表達(dá)的是真核蛋白，可能問題更復(fù)雜，可能涉及到伴侶蛋白等問題？

f有人會(huì)檢測(cè)mRNA的穩(wěn)定性。

g可以用親和層析等辦法富集你的目的蛋白，然后再跑膠。因?yàn)橛袝r(shí)你的目的蛋白表達(dá)豐度過低，SDS檢測(cè)不到。

（1）提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長(zhǎng)與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。

（2）IPTG：IPTG濃度0.2-0.5mMIPTG足夠了，不會(huì)降低表達(dá)量，反而會(huì)增加蛋白的可溶性。IPTG濃度過高，易使蛋白表達(dá)速度增大，來不及正確折疊而產(chǎn)生不溶性蛋白（包涵體）。T7lac啟動(dòng)子是嚴(yán)謹(jǐn)啟動(dòng)子，IPTG誘導(dǎo)時(shí)可以優(yōu)化最佳濃度（25uM-1mM之間）使目的蛋白達(dá)到最佳的活性和溶解性。

（3）溫度：一般37℃誘導(dǎo)3-4小時(shí)，30℃誘導(dǎo)6小時(shí)是蛋白表達(dá)的最大產(chǎn)量期。22℃、18℃、16℃等低溫誘導(dǎo)時(shí)間在12h-48h。低溫誘導(dǎo)可使蛋白緩慢合成，利于蛋白正確折疊形成可溶性蛋白。為了得到更多的可溶性蛋白，可以考慮將溫度再降（但表達(dá)總量會(huì)有所降低），可以考慮25°，誘導(dǎo)8-10個(gè)小時(shí)；20°誘導(dǎo)14-18個(gè)小時(shí)；甚至15°24-36小時(shí)誘導(dǎo)。

二、檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)1.細(xì)菌的裂解裂

常用方法有：①高溫珠磨法；②高壓勻漿；③超聲破碎法；④酶溶法；⑤化學(xué)滲透等。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法①、②已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。

下面介紹酶溶法和超聲破碎法結(jié)合使用的實(shí)驗(yàn)步驟。

（1）常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3-葡聚糖酶；β-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類有作用，而其他幾種酶對(duì)酵母作用顯著。4℃，5000rpm離心，15min，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（30mL）。棄上清，1mL裂解緩沖液，懸浮沉淀，30℃作用1h。

（2）超聲破碎細(xì)菌，40w,10s,10s,50次；12000rpm,4℃離心，15min，分別收集上清液和沉淀。分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2×凝膠電泳加樣緩沖液，待檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)3-4次凍溶后更容易破碎。

2．進(jìn)行SDS–PAGE檢測(cè)

（1）表達(dá)結(jié)果：

a細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；b包涵體形式表達(dá)。

（2）包涵體的純化

a包涵體的洗滌；b包涵體的溶解；c包涵體的檢測(cè)

從基因角度改造一下，如果能夠去掉一些疏水區(qū)段會(huì)很大程度上改善蛋白的可溶性

（4）注意事項(xiàng)

a所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性；

b根據(jù)自己的需要選擇不同的表達(dá)載體，并注意不同的表達(dá)載體上的融合標(biāo)簽和攜帶的抗性基因，其中有些標(biāo)簽是可以去除的。具體的序列和說明

都可以從中下載。

c包涵體蛋白溶液保存在四度里，避免反復(fù)凍融，否則體系不穩(wěn)定，蛋白以沉淀析出；胞質(zhì)蛋白不能在四度放置很久，因?yàn)樯锨逯泻泻芏嗟鞍酌?，?huì)把靶蛋白降解掉。1.了解實(shí)驗(yàn)課題對(duì)目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達(dá)目的（是蛋白結(jié)晶、藥劑結(jié)合還是制備抗體，不同目的對(duì)蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內(nèi)表達(dá)還是分泌表達(dá)，是組成型表達(dá)還是誘導(dǎo)型表達(dá)；另外，還要了解蛋白表達(dá)后需要采用什么樣的方式進(jìn)行純化，純化標(biāo)簽有多大，蛋白純化后是否需要將標(biāo)簽去除（即標(biāo)簽的存在是否會(huì)影響蛋白的活性）。還要對(duì)目的蛋白進(jìn)行稀有密碼子（僅限于真核生物基因通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)時(shí)參考，注意稀有密碼子的多少，位置5位或3位，稀有密碼子是否成串出現(xiàn)等）和可溶性網(wǎng)上預(yù)測(cè)等。稀有密碼子預(yù)測(cè):///~mmaduro/codonusage/usage.htm:///~sumchan/caltor.html原核表達(dá)蛋白可溶性預(yù)測(cè)綜合以上，選取合適的表達(dá)載體及宿主菌。注意：不是所有的標(biāo)簽都是用來純化蛋白的，有的標(biāo)簽有促進(jìn)蛋白溶解的作用，有的則是二硫鍵形成或利于表達(dá)后蛋白的檢測(cè)。一般我們最常用的是胞內(nèi)誘導(dǎo)型表達(dá)（即蛋白翻譯后是存在于細(xì)胞內(nèi)，通過加誘導(dǎo)物的方法來控制表達(dá)水平）。2.搜索要表達(dá)的目的基因的序列，根據(jù)其編碼區(qū)序列來設(shè)計(jì)引物；注意：要注意在引物上加入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)（首先應(yīng)分析蛋白編碼區(qū)內(nèi)是否含有相同的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)），并通過查閱資料看兩種酶（上下游引物分別加入酶切位點(diǎn)）是否可以在同一反應(yīng)體系中起作用，并注意標(biāo)簽序列是在N端還是在C端，若要在C端保留標(biāo)簽，則需要將下游引物的終止密碼子替換掉；若要在引物上引入標(biāo)簽序列，則引物上應(yīng)加入標(biāo)簽序列堿基（即在上游引物或下游引物處引入His的密碼子）；另外，還要注意引物不能造成蛋白的編碼框發(fā)生改變；1，2步的分析至關(guān)重要，只有在完成前兩步的工作后才可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。3.搖菌，進(jìn)行RNA抽提（注意選取不同表現(xiàn)型的菌株），搖菌的時(shí)間一定不要太長(zhǎng)，太長(zhǎng)的話RNA活性不高；4.mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA（此步應(yīng)在第三步完成后立即操作，RNA存放時(shí)間長(zhǎng)易降解）；5.以cDNA為模板，利于設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；6.通過膠回收試劑盒回收目的DNA片段。真核基因組DNA的克隆

cDNA的克隆化技術(shù)的成熟，很多染色體的mRNA互補(bǔ)的序列已弄清楚，為豐富人體遺傳信息庫(kù)做出了貢獻(xiàn)。除此以外，真核細(xì)胞染色體DNA消化后的片段，合適的載體進(jìn)行克隆，也是得到目的基因的重要方法。染色體DNA序列大部分含有插入序列，即內(nèi)含子（intron)．內(nèi)含子的數(shù)量不等。而cDNA則僅代表了外顯子(exon）的序列。大腸桿菌等原核細(xì)胞不能識(shí)別真核細(xì)胞染色體DNA的內(nèi)含子，因此其表達(dá)研究，僅可應(yīng)用cDNA，而不能應(yīng)用真核基因組帶有內(nèi)含子的DNA，基因治療中的目的基因，既可選擇。DNA，也可選擇染色體DNA。

一、染色體DNA克隆的載體

構(gòu)建染色體DNA文庫(kù)并進(jìn)行克隆的載體有兩大類：入噬菌體載體和粘粒載體。質(zhì)粒載體其容量有限，而染色體DNA由于帶有內(nèi)含子序列而較長(zhǎng)；單鏈絲狀噬菌體載體僅用于克隆單鏈DNA,因此質(zhì)粒載體和單鏈絲狀噬菌體載體都不適用干染色體DNA的克隆。

由于粘?？山蛹{近45kb的外源DNA，幾乎是入噬菌體載體載量的2倍，因此，在一個(gè)哺乳動(dòng)物基因組DNA文庫(kù)中，僅需350000個(gè)重組枯粒，則可望某一特定的單拷貝序列存在于其中的概率達(dá)99％。然而，在粘粒中構(gòu)建和貯存文庫(kù)要比在入噬菌體中更困難得多，因而只有當(dāng)靶基因過大，而不能為單個(gè)入噬菌體所包容，或者要分離一系列跨過染色體DNA特大區(qū)段的重疊克隆時(shí)，才采用粘粒。染色體DNA克隆最為常用的載體還是入噬菌體載體。

以入噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體盡管已是分離眾多真核cDNA及基因組DNA的有力工具，但它們也只能接納大小在一定范圍內(nèi)的插入片段。許多基因由于過于龐大，而不能作為單一片段克隆于這些載體之中，如人凝血因子訊基因長(zhǎng)達(dá)180kb，肌營(yíng)養(yǎng)不良基因至少長(zhǎng)1800kb，因此需要建立容量更大的克隆載體。

酵母人工染色體（YAC）方法的建立，使克隆DNA大區(qū)段的工作至少有了可循之經(jīng)。使用YAC載體進(jìn)行克隆時(shí)，基因組DNA須在剪切力較小的條件下從實(shí)驗(yàn)組織中小心制備，以便得到平均數(shù)百萬堿基對(duì)大小的片段。隨后應(yīng)用一限制酶（如EcoRD部分消化DNA，以產(chǎn)生平均大小為20。一500kb的大片段‘這些片段再連接到經(jīng)過適當(dāng)處理以防止自身環(huán)化的YAC載體兩臂上。除EooRI以外，也可用Notl和Mlul一類切點(diǎn)稀少的限制酶進(jìn)行完全消化。

二、從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離

高分子量DNA

哺乳功物DNA的分離通常是在有EDTA和SDS一類的去污劑存在！、一l!l蛋白酶K，消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。低分子量的雜質(zhì)以透析法加以去除。這一方法獲得的DNA，其大小為100一150kb．適用于以入噬菌體載體構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。然而，若要用粘粒建立基因組DNA文庫(kù)，則要求用更大的DNA。

從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離高分子量的DNA有如下三種辦法。

1．單層貼壁生長(zhǎng)或懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，組織標(biāo)本及血液標(biāo)本中的細(xì)胞，利用蛋白酶K,SDS和酚等，可分離純化1。。一1sokb大小的DN段，適用于入噬菌體載體構(gòu)建DNA文庫(kù)。

2．將細(xì)胞、組織碎片或血液細(xì)胞標(biāo)本，以蛋白酶K進(jìn)行消化，應(yīng)用高濃度甲酞胺使DNA從DNA一蛋白質(zhì)復(fù)合物中解離，再通過火棉膠袋透析，去除殘存的蛋白酶K，因而省去酚等有機(jī)溶劑抽提等步驟。由于DNA未經(jīng)機(jī)械振搖，不通過移液管的操作和酒精沉淀，故其分子量特別大，缺點(diǎn)是收獲率小，DNA濃度低。

3．以鹽酸服裂解細(xì)胞，所生成的DNA較短（約SOkb.)，但此法簡(jiǎn)便快速，并可用來同時(shí)處理不同的細(xì)胞或組織中抽提DNA,這一方法制備的DNA盡管不應(yīng)用于構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)，但用于Southem雜交則效果極佳。

三、染色體DNA文庫(kù)的建立

不論DNA的堿基組成及序列，而以真正隨機(jī)的方式將DNA打斷成片段的唯一方法就是機(jī)械剪切。但由此方法制備的染色體DN段的末端，并非用于克隆的粘性末端，需要進(jìn)一步處理。包括末端的修復(fù)、甲基化、與接頭連接并以合適的內(nèi)切酶進(jìn)行消化以便產(chǎn)生合適的粘性末端。

經(jīng)過機(jī)械剪切或限制性內(nèi)切酶的消化，產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度也不一致，必須通過密度梯度離心純化，才能得到所需的大小的片段。

按照。DNA克隆化中程序的方法，將入噬菌體載體用合適的限制性內(nèi)切酶消化，然后再與處理過的染色體DNA在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，進(jìn)行大規(guī)模地包裝反應(yīng)，并建立預(yù)期大·小的基因組DNA文庫(kù)。

基因組DNA文庫(kù)建立以后，還必須對(duì)此文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增。

四、染色體DNA文庫(kù)的篩選一’

染色體DNA文庫(kù)的篩選主要是應(yīng)用Southern雜交分析方法等。

1．將可疑陽性克隆，快速小量法提取DNA，以同位素或地高辛等標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，顯影或顯色分析。

2．入噬菌體噬菌斑的原位雜交先將入噬菌體的噬菌斑在硝酸纖維素膜上或尼龍膜上進(jìn)行固定，入噬菌體噬菌斑也可以原位進(jìn)行擴(kuò)增后再固定．然后對(duì)入噬菌體分離物

進(jìn)行快速分離快速分

析．

3.DNA序列分析克隆的DN段，最后以DNA序列分析，加以證實(shí)石河子大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)課論文綠色熒光蛋白(GFP)原核表達(dá)分析學(xué)生姓名學(xué)號(hào)專業(yè)年級(jí)、班級(jí)指導(dǎo)教師所在學(xué)院中國(guó)·新疆·石河子2021年1月綠色熒光蛋白(GFP)原核表達(dá)分析摘要：本實(shí)驗(yàn)主要探討目的蛋白（GFP）在大腸桿菌中的表達(dá)的情況以及鑒定目的蛋白形成的是包涵體還是可溶性蛋白。本實(shí)驗(yàn)先對(duì)菌液進(jìn)行培養(yǎng)、活化、然后采用IPTG分別對(duì)其不同時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)，用SDS來確定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP誘導(dǎo)不同時(shí)間的表達(dá)情況的檢測(cè)方法。關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白；SDS；原核表達(dá)1前言實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆站酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的原理和操作方法；了解重組載體的構(gòu)建方法；鍛煉學(xué)生查閱文獻(xiàn)資料、設(shè)計(jì)與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的能力；加強(qiáng)學(xué)生對(duì)化學(xué)生物學(xué)中常用研究方法的認(rèn)知。實(shí)驗(yàn)背景綠色熒光蛋白（greenfluorescentproteinGFP)是源于多管水母屬等海洋無脊椎動(dòng)物的發(fā)光蛋白，其在藍(lán)光或紫外光下可發(fā)出明亮的綠色熒光，可以作為報(bào)告基因檢測(cè)蛋白的特異性表達(dá)或進(jìn)行細(xì)胞定位研究。與以往lacZ、CAT等報(bào)告基因相比，有很多無可比擬的優(yōu)越性:GFP不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達(dá)；熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性高；不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光,尤其適用于體內(nèi)的即時(shí)檢測(cè)；另外GFP分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對(duì)受體無毒害,安全可靠；并且通過替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。正是由于GFP檢測(cè)具有高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，無需使用同位素等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域。綠色熒光蛋白還在監(jiān)測(cè)目的基因表達(dá)、研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝及追蹤細(xì)胞系的分化等方面有著廣泛應(yīng)用。采用GFP作為標(biāo)記基因，可直接收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)，縮短了篩選時(shí)間、減少對(duì)細(xì)胞活性的影響并可作為活體標(biāo)記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機(jī)制提供了一種簡(jiǎn)潔有效的手段。同時(shí)也正因?yàn)槠錈晒夥磻?yīng)不是酶反應(yīng)，所以當(dāng)細(xì)胞本身還存在一些可以受藍(lán)光激發(fā)和產(chǎn)生綠色熒光的物質(zhì)，或者GFP表達(dá)頻率不高的情況下，GFP的檢測(cè)可能會(huì)產(chǎn)生一些假相，不易對(duì)熒光進(jìn)行定量的測(cè)定。我們利用基因工程手段在大腸桿菌中高效的表達(dá)了GFP，制備出GFP抗體，利用抗原與抗體之間的特異性，在體外對(duì)GFP進(jìn)行檢測(cè)，可在一定程度上彌補(bǔ)上述GFP檢測(cè)中可能出現(xiàn)的問題，可以作為一種重要的輔助手段用以提高GFP檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。原核表達(dá)是將克隆基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌，用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法。選用原核表達(dá)系統(tǒng)的原因是易于生長(zhǎng)和控制、用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料昂貴、有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)粒可供選擇。但是在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。包涵體是在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，形成被膜包裹的結(jié)構(gòu)，具有水不溶性的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要是通過SDS來檢測(cè)綠色熒光的原核表達(dá)情況。流程圖：2材料與方法2.1材料2.1.1實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒DNA;PCR產(chǎn)物、酶切質(zhì)粒、DNAMarker;外源DNA片段：PCR擴(kuò)增回收目的片段A和PGM-Tvector(Amp’,lacZ),帶限制性內(nèi)切酶末端的DNA溶液（目的片段A和載體片段pBL）;E.coliDH-5α受體菌（R-M-），自提的質(zhì)?；蛑亟M子;重組質(zhì)粒DNA的菌落、BL21;重組GFP質(zhì)粒、標(biāo)準(zhǔn)蛋白。2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀、PCR管、移液槍、離心機(jī)、電泳儀、渦旋振蕩器、冰箱、透射儀、紫外透射儀、刀片、臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、微量移液槍、Eppendorf管、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、制冰機(jī)、振蕩培養(yǎng)箱、移液器、搖床、酒精燈、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精棉球、滅菌槍頭、分光光度計(jì)。2.1.3實(shí)驗(yàn)試劑模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buffer(內(nèi)含Mg2+)、ddH2O、pGM-T載體、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，其它生化試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1PCR擴(kuò)增目的基因片段依次混勻下列試劑，反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)體系各成分的量ddH2O9.5l上游引物1.0l下游引物1.0l模板DNA1.0lTaqDNA聚合酶12.5lTotal25l混勻后瞬時(shí)離心(2)將PCR管放入PCR儀中，設(shè)定PCR儀的循環(huán)參數(shù)。預(yù)變性94℃3min，變性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃40s30個(gè)循環(huán)?？傃由?2℃4min；溫度時(shí)間預(yù)變性94℃3min變性94℃30S退火52℃30S延伸72℃40S總延伸72℃240S(3)PCR擴(kuò)增完畢后，取出PCR管放在冰盒上；(4)取5l擴(kuò)增后產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。2.2.2目的基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（1）加20ml1×TAE緩沖液于三角瓶中；（2）精確稱取0.2g瓊脂糖加到三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化；（3）冷卻至60℃左右，加1μl的Goldview溶液，搖勻；（4）輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上；（5）輕輕拔除梳子，將膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液（TAE），使電泳緩沖液剛好沒過凝膠約1mm；（6）取5μl質(zhì)粒DNA及2μl加樣緩沖液混勻上樣；（7）110v約電泳0.5～1小時(shí)；（8）紫外透射儀觀察結(jié)果。2.2.3DNA的回收和純化回收PCR產(chǎn)物（采用天根時(shí)代DNA回收試劑盒）:（1）用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來，分別放入1.5ml離心管中；（2）以0.1g凝膠對(duì)應(yīng)300μl的體積加入PN;（3）50℃水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動(dòng)離心管至膠完全溶解；（4）將上述的得到的溶液加入到一個(gè)吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12000rpm離心60s，棄掉廢液；（5）加入700μl漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄掉廢液；（6）加入500μl漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄掉廢液；（7）將離心吸附柱放回收集管，12000rpm離心2min；（8）取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液EB30μl，洗脫緩沖液先在65℃水浴預(yù)熱，冷卻至室溫，12000rpm離心1min，然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，12000rpm離心1min；（9）電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物，余置于-20℃下保存。透射儀觀察結(jié)果，并拍照。2.2.4重組質(zhì)粒的連接把PCR擴(kuò)增的目的基因片段產(chǎn)物與pGM-T載體連接，反應(yīng)體系如下：體系成分體系成分體積(μL)ddH2O3.510×T4DNA1.0目的片段（回收）4.0pGM-T載體0.5T4DNAligase1.0Total10.0大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaCl2法。（1）將實(shí)驗(yàn)室保存的E.coliDH-5α菌株甘油管用無菌去離子水1:100稀釋后，平板劃線法接種在無抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，見有菌落長(zhǎng)出，用接種環(huán)從平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到20ml無抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm震蕩培養(yǎng)過夜，活化E.coliDH-5α菌株；（2）按照1%接種量，從上述培養(yǎng)液中吸取菌液2ml，轉(zhuǎn)瓶接入200ml新鮮的無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃,200rpm震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5左右；（3）在已滅菌的10ml離心管中吸取上述培養(yǎng)液10ml，冰水浴10min后，4℃、6000rpm離心2min，收集菌體，棄上清；（4）加2ml冰冷預(yù)熱的0.1mol/LCacl2溶液，重懸菌體，冰浴10min，4℃、6000rpm離心2min，收集菌體，棄上清；（5）將每一份沉淀輕緩地懸于0.4～1ml含有20%甘油的0.1mol/LCacl2的溶液中，輕輕重懸菌體沉淀，冰上放置10分鐘；（6）分裝100μL/管（冰浴分裝），置于-70℃冰箱中保存。2.2.6連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(1)轉(zhuǎn)化用固體LB培養(yǎng)基平板制備：向含100μg/ml氨芐青霉素（AMP）的固體LB培養(yǎng)基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的X-gal40μL，用滅菌彎頭玻璃棒涂布均勻，37℃避光倒置3h，讓溶解X-gal的二甲基甲酰胺盡量揮發(fā)干凈。加入ITPG和X-gal的轉(zhuǎn)化用平板應(yīng)避光保存，以防試劑見光分解。（2）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH-5α感受態(tài)細(xì)胞：①取5μl連接產(chǎn)物加到100μlE.coliDH-5α感受態(tài)細(xì)胞中。輕彈混勻，水浴20min。②取出離心管，42℃水浴中熱激90后，立即置冰浴中冷卻5min。③向離心管中加入800μL37℃預(yù)熱的無抗生素的LB液體培養(yǎng)基。④取出離心管，12000rpm離心2min，棄上清800μL，用剩余的約100μL上清將沉淀菌體吸打混勻后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。將平板倒置在37℃恒溫箱中培養(yǎng)14h～18h，直至長(zhǎng)出菌落，觀察結(jié)果。重組質(zhì)粒的菌落鑒定本次實(shí)驗(yàn)所用的pGM-Tvector含Ampr、lacZ基因，所以有重組質(zhì)粒的菌落為白色，沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。具體操作如下：①挑取菌落：使用無菌槍頭隨即挑取5個(gè)白色菌落，放入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的1.5mlEP管，振蕩培養(yǎng)4h以上，吸取0.5ul菌液作為PCR反應(yīng)模板，其余繼續(xù)培養(yǎng)。②PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序均與目的基因擴(kuò)增條件一致。③擴(kuò)增產(chǎn)物取5ul用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。2.2.8提取重組質(zhì)粒將鑒定為陽性重組子的質(zhì)粒EP管挑取出來，按照實(shí)驗(yàn)室提取質(zhì)粒的試劑盒說明書操作。提取后，取5ul用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。2.2.9重組質(zhì)粒雙酶切用限制性內(nèi)切核酸酶BamHⅠ和SalⅠ對(duì)PCR陽性菌落提取的質(zhì)粒做雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系如下表。體系成分體積質(zhì)粒5.0ul去離子水11ul10×BufferT3.0ulBamHⅠ（120U/ul）0.5ulSalⅠ(100U/ul)0.5ul總體積20ul37℃酶切過夜，70℃滅活酶活性。1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。2.2.10GFP基因重組表達(dá)質(zhì)粒及誘導(dǎo)表達(dá)（1）將上步經(jīng)酶切鑒定得到的GFP目的片段與表達(dá)質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株。轉(zhuǎn)化菌涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；（2）觀察菌落生長(zhǎng)情況，進(jìn)行菌落PCR鑒定；（3）將鑒定為陽性的菌落接種于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)過夜。（4）按1:100稀釋過夜菌，接種于100ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌繼續(xù)培養(yǎng)至A600約為0.4-0.8。（5）取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為1mmol/L，于37℃誘導(dǎo)表達(dá)。每隔1h分別取菌體1ml，離心12000g，30s得到沉淀，觀察蛋白表達(dá)情況。2.2.11SDS檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白（1）取未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)不同時(shí)間的培養(yǎng)物500ul于微量離心管中，室溫高速離心1min。沉淀懸浮于100ul1×SDS凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱3min，室溫高速離心1min后，冰上放置。（2）安裝電泳裝置，配制12%分離膠倒入凝膠槽，加蒸餾水密封。待凝固后再倒入5%濃縮膠，插上梳子。待凝固后，拔出梳子，放入電泳槽中，上樣，電泳。（3）電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在染色液中，室溫在搖床上緩慢染色4h。（4）脫染：將染液回收，凝膠先用蒸餾水漂洗一次后侵入脫染液中脫染，更換幾次脫色液，直至出現(xiàn)清晰的電泳帶。（5）脫色后，將凝膠保存在水中或是含20%甘油的水中；（6）觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3結(jié)果與分析3.1PCR擴(kuò)增目的基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)M為Marker，1-4為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物長(zhǎng)度約為750bp，由于實(shí)驗(yàn)疏忽不嚴(yán)謹(jǐn)，條帶不明顯且不明確。3.2DNA回收電泳檢測(cè)由于操作不當(dāng)，DNA片段分解了，沒有回收到電泳條帶。3.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的藍(lán)白斑篩選將目的基因片段與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α菌株感受態(tài)，37℃，培養(yǎng)16h以后得到藍(lán)白斑的菌落，白色菌落即有可能為含重組子的菌落（如下圖）。箭頭所指處為藍(lán)色菌落3.4外源基因誘導(dǎo)表達(dá)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后呈現(xiàn)綠色，說明含外源基因GFP的質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功表達(dá)。綠色熒光的亮度增加說明隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，GFP基因表達(dá)量增加，而沒有經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體則不發(fā)出綠色熒光（如下圖）。3.5GFP原核不同條件的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè)將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白處理后進(jìn)行SDS檢測(cè),確定其分子量大小?？梢钥吹?，誘導(dǎo)時(shí)間不同蛋白表達(dá)量不同，條帶顏色不一樣。由于實(shí)驗(yàn)疏忽，電泳條帶不明顯到時(shí)實(shí)驗(yàn)失敗。電泳帶淡有三種可能原因：（1）電泳時(shí)，點(diǎn)樣后等待時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致點(diǎn)樣液擴(kuò)散。（2）目的質(zhì)粒濃度低。（3）機(jī)器曝光時(shí)間不對(duì)。在實(shí)驗(yàn)過程中，等待點(diǎn)樣時(shí)間較長(zhǎng)，原因1有可能。在電泳帶底部見模糊陰影，可能有雜DNA污染。我們并非在無菌的條件下做實(shí)驗(yàn)，電泳口也可能有雜質(zhì)，PCR時(shí)也可能載體自連產(chǎn)生假陽性，這些情況都可能造成目的質(zhì)粒濃度低。其他組的電泳結(jié)果也不是很亮，所以還可以調(diào)整曝光時(shí)間試試。4心得體會(huì)本實(shí)驗(yàn)涉及知識(shí)面廣，需要綜合利用分子生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、基因工程和微生物學(xué)中的基礎(chǔ)理論知識(shí)和技術(shù)，有利于學(xué)生對(duì)幾個(gè)學(xué)科間知識(shí)的融會(huì)貫通。實(shí)驗(yàn)中涉及步驟較多，需要1～2周時(shí)間才能完成，因此較適合作為高年級(jí)學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)者的實(shí)驗(yàn)技能要求較高，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)用到一系列基本操作方法，需使用多種實(shí)驗(yàn)儀器，可以綜合鍛煉學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，教師要注意加強(qiáng)引導(dǎo)，實(shí)施開放式教學(xué)，給學(xué)生創(chuàng)建一個(gè)獨(dú)立工作的環(huán)境。同時(shí)學(xué)生也可通過查閱文獻(xiàn)，對(duì)給定的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，有利于開闊學(xué)生的視野，培養(yǎng)學(xué)生解決問題、分析問題的能力。綠色熒光蛋白是現(xiàn)代化學(xué)生物學(xué)中常用的一種分子成像標(biāo)記物，被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中。由于綠色熒光蛋白在紫外光激發(fā)下可以發(fā)出明亮的、肉眼可見的綠色熒光，有利于激發(fā)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)熱情，提高學(xué)生學(xué)習(xí)化學(xué)生物學(xué)的興趣。由于本實(shí)驗(yàn)使用可進(jìn)行親和純化的表達(dá)載體，因此也可以進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)純化及蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[1]薛啟漢.綠色熒光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，01:54-60.[2]唐孝青，李斌，伍小兵，張亮.綠色熒光蛋白及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，01:123-124+145.[3]KainSR，AdamsM，KondepudiA，eta.lGreenfluorescentproteinasareporterofgeneexpressionandproteinlocalization.biotechniques，1995，19(4):650[4]PhillipsGJ.Greenfluorescentproteinabrightideaforthestudyofbacterialproteinlocalization.FEMSmicrobialLet，t2001，204(1):9[5]邱金枚，趙玉平.聚丙烯酰胺凝膠電泳常見問題分析與預(yù)防措施[J].種子科技，2003，02:43-44.[6]胡曉倩，陳來同，趙健.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法[J].中國(guó)生化藥物雜志，2021，02:128-130.[7]胡承香，張玉純，李磊，顧長(zhǎng)國(guó).SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的改良及其應(yīng)用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，01:68-70.[8]霍海龍，趙躍，王銳，侯慧芳，李衛(wèi)真，張永云，劉麗仙，王配，霍金龍.綠色熒光蛋白基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-AcGFP1的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2021，06:820-825.[9]王藝霖，趙麗偉，李昆志.擬南芥Dof1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2021，02:195-202.[10]趙靜，丁麗華，仇瑋祎，牛暢，陳力權(quán)，甘純璣，葉棋濃.GST-His雙標(biāo)簽原核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊，2021，04:520-522.第一步:對(duì)病人進(jìn)行胸膜腔穿刺術(shù)前的準(zhǔn)備1。了解病情及穿刺目的，核對(duì)適應(yīng)癥（1)診斷：抽胸水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查;（2）治療：抽液或抽氣減壓；腹腔內(nèi)注射藥物。觀看有無禁忌癥：（1）嚴(yán)重出血疾??；(2）體質(zhì)衰弱不能耐受手術(shù)者。2。向病人介紹穿刺目的及其并發(fā)癥，并請(qǐng)其配合,簽署胸膜腔穿刺同意書。3.消除顧慮，必要時(shí)可術(shù)前半小時(shí)服安定10mg或可待因0。03g。4。詢問有無藥物（特別是局麻藥利多卡因）過敏史。5。術(shù)前測(cè)脈搏、血壓。6。安置病人適當(dāng)?shù)捏w位，對(duì)照輔助檢查再次進(jìn)行簡(jiǎn)單的物理診斷，復(fù)核相關(guān)的體征，確定穿刺點(diǎn)并以龍膽紫標(biāo)出進(jìn)針點(diǎn)。7。囑病人排尿。第二步:胸膜腔穿刺的檢查物品是否齊全1、消毒包和無菌鑷子（消毒日期是否在有效期內(nèi))、消毒缸(0。5％碘伏)。2、一次性胸膜腔穿刺包（消毒日期是否在有效期內(nèi)）.3、藥品:2%利多卡因注射液5ml×1支、0。1％腎上腺素注射液1ml×1支。4、無菌手套2雙、無菌口罩和帽子1付。5、注射器：5ml、20ml、50ml注射器各2具.6、其它：護(hù)創(chuàng)膏、血壓計(jì)、聽診器、盛胸水的容器及其化驗(yàn)單。第三步：醫(yī)生的準(zhǔn)備1、人文關(guān)懷：自我介紹,謝謝病人的配合。2、帶口罩和帽子。3、將病人送到經(jīng)過消毒的治療室。4、當(dāng)著病人的面洗手（六部洗手法）。操作階段第一步:擺放穿刺體位病人取坐位面向椅背，兩前臂置于椅背上。不能起床者取半臥位，雙前臂上舉抱于枕部。第二步：再次確定穿刺部位1.肋間定位：上述體位下，肩胛下角對(duì)應(yīng)第7～8肋.2.常規(guī)穿刺點(diǎn)：胸部叩診實(shí)音最名顯處，常取肩胛線或腋后線7～8肋間.3。特殊穿刺點(diǎn)：包裹性積液可結(jié)合X線或B超定位。4。氣胸穿刺點(diǎn):鎖骨中線第二肋間，下一肋骨上緣。第三步：局部消毒1。查看消毒包和無菌鑷子消毒日期,打開無菌鑷子和消毒包中的消毒碗。2.用無菌鑷子在消毒缸中夾取適量的0。5％碘伏消毒棉球放入消毒碗中.3。左手持無菌鑷子夾起消毒碗中的碘伏消毒棉球，十字交叉?zhèn)鹘o右手中的無菌鑷子（禁止兩個(gè)鑷子相碰）.4。右手中的無菌鑷子夾著消毒棉球,按壓標(biāo)記的穿刺點(diǎn)，以穿刺點(diǎn)為圓心，由內(nèi)向外無間隙劃圓形擦拭，消毒范圍直徑不小于15cm。5.把消毒后的棉球放入第二個(gè)空消毒碗中。6.進(jìn)行第二次消毒：重復(fù)3)、4）、5）步驟，(注意第二次的消毒范圍應(yīng)該略小于第一次，棉球應(yīng)由內(nèi)向外擦拭）.7.收拾消毒包中的物品，把消毒后的棉球放入醫(yī)療垃圾袋中.第四步：局部麻醉1.術(shù)者打開穿刺包，查看消毒日期，戴無菌手套，檢查手術(shù)器械（注意注射器乳頭是否與穿刺針吻合，針頭是否銳利）。2.術(shù)者鋪洞巾，用止血鉗固定，3。助手協(xié)助術(shù)者核對(duì)麻藥的名稱及濃度，消毒安瓿，打開麻藥,術(shù)者抽取麻藥（注意針頭不能碰到安瓿瓶口）。4。第3次確定穿刺部位，用2％利多卡因在穿刺點(diǎn)處沿下一肋骨上緣行浸潤(rùn)性局麻。5。先在皮膚局部打個(gè)皮丘，再垂直進(jìn)針，分層麻醉至胸膜壁層（注意推麻藥前要回抽,了解是否在血管內(nèi),同時(shí)要掌握深度）。6。麻醉完畢后，按壓片刻,操作過程中要隨時(shí)詢問和觀察病人有無不適感覺.第五步：胸膜腔穿刺術(shù)1.檢查穿刺針是否銳利,穿刺針連接的橡皮管是否通常和密閉。2。將于穿刺針連接的橡皮管夾閉,用無菌紗布包裹穿刺針后的橡皮管，3。術(shù)者再次確定進(jìn)針點(diǎn),左手食、中指固定穿刺點(diǎn)皮膚，4。右手持穿刺針沿麻醉處緩慢刺入，當(dāng)?shù)挚垢型蝗幌r(shí)，考慮穿刺成功.5。接上注射器，打開橡皮管，緩慢抽液。6。助手戴無菌手套，待術(shù)者抽滿后夾閉橡皮管，如需要,助手可用止血鉗固定針管。7.術(shù)者取下注射器，留取適量的胸水放置到檢查容器中，多余的胸水推入盛胸水的容器（注意注射器頭不能碰在容器上)，注意不要出現(xiàn)胸水污染。

8。治療性穿刺：可反復(fù)重復(fù)5）、6)、7)。9。穿刺完畢后拔出穿刺針，覆蓋無菌紗布,稍用力壓迫片刻，防止出血、氣胸及滲水,針眼處以0。5％碘伏消毒,覆蓋無菌紗布，護(hù)創(chuàng)膏固定.注意事項(xiàng)：1.術(shù)中密切觀察,如有頭暈、出汗、心悸、劇痛、暈厥等胸膜反應(yīng)或連續(xù)咳嗽、咳泡沫痰時(shí),立即停止抽液，必要時(shí)可皮下注射0。1％腎上腺素0.3～0。5ml。2.一次抽液不可過快，診斷性抽液50～100ml即可；治療性抽液，首次不超過600ml，以后每次不超過1000ml。但若為膿胸，每次應(yīng)盡量抽凈.3。標(biāo)本需要做化驗(yàn)時(shí),應(yīng)于抽液后立即送檢。欲找瘤細(xì)胞之標(biāo)本送檢不能少于100ml.4.操作中必須嚴(yán)格無菌，防止空氣入胸腔，始終保持胸腔負(fù)壓。5.要避免在第9肋間以下穿刺，以免損傷腹腔臟器。術(shù)后處理1。術(shù)后囑病人平臥、詢問病人有無任何不適。2.再次測(cè)脈搏、血壓,復(fù)核物理體征。3。醫(yī)囑病人穿刺點(diǎn)三天不能沾水。4.收拾醫(yī)療用物，進(jìn)行醫(yī)療垃圾分類放置。5.感謝病人的配合，護(hù)送病人回病房.6.及時(shí)送檢胸水標(biāo)本進(jìn)行檢查。7。及時(shí)書寫穿刺記錄：24小時(shí)內(nèi)完成。內(nèi)容包括：1)一般情況（病人信息)。2）手術(shù)時(shí)體位，皮膚消毒，鋪洞巾的方法.3)手術(shù)名稱4)麻醉方式5)手術(shù)步驟6）術(shù)中病情變化和處理7)術(shù)后醫(yī)囑8）標(biāo)本送檢情況如何實(shí)施績(jī)效管理步驟

人力資源體系已經(jīng)開始運(yùn)作，其中最核心模塊的是績(jī)效管理，只有通過績(jī)效管理的有效實(shí)施，才能真正把企業(yè)的目標(biāo)與員工的價(jià)值創(chuàng)造結(jié)合起來，把企業(yè)的發(fā)展與員工的發(fā)展結(jié)合起來，才能真正讓“選、育、用、留”四大支柱支撐起人力資源的大廈?？?jī)效管理與傳統(tǒng)意義上的考核關(guān)鍵區(qū)別在于：績(jī)效管理的主要目標(biāo)是改進(jìn)與提升績(jī)效；績(jī)效考核是績(jī)效管理中的一個(gè)環(huán)節(jié)，其主要目的是發(fā)現(xiàn)問題，找到改進(jìn)點(diǎn)，形成績(jī)效的改進(jìn)計(jì)劃與個(gè)人發(fā)展計(jì)劃?？?jī)效管理的每一步都是圍繞這個(gè)目的而開展的。

要達(dá)成績(jī)效管理的目標(biāo)需要上下的高度重視、全員的參與、長(zhǎng)期的堅(jiān)持，但這并不意味著績(jī)效管理是如何復(fù)雜。實(shí)際上績(jī)效管理作為有效的管理工具，從管理的角度來看，恰恰是要將復(fù)雜的工作簡(jiǎn)單化、程序化，可以用四個(gè)字來涵蓋它：“目標(biāo)+溝通”。通過目標(biāo)的制定把上級(jí)的要求、希望改進(jìn)提升的方面等清晰地傳遞給下級(jí)，并通過溝通達(dá)成雙向承諾；通過過程中上下級(jí)圍繞目標(biāo)持續(xù)有效的溝通過程，輔導(dǎo)員工、解決問題、不斷糾偏、客觀評(píng)價(jià)、達(dá)成共贏。

各級(jí)管理者是績(jī)效管理的第一責(zé)任人，績(jī)效管理是管理者必須要做的工作，決不是一項(xiàng)“上面布置的額外任務(wù)”。績(jī)效管理的結(jié)果客觀反映了管理者管理水平。因此，對(duì)績(jī)效管理的實(shí)施而言，需要各級(jí)管理者遵循既定原則，發(fā)揮主觀能動(dòng)性，把工作做的更好。所謂原則即是不變的東西，即是無論在何種情況下，無論在何種狀態(tài)下都要嚴(yán)格遵循的東西。在績(jī)效管理中，有三條原則：

1、公正、公平、公開。

2、目標(biāo)制定由上而下，完成目標(biāo)的過程由下而上。

3、溝通、溝通、再溝通。

為了達(dá)成這三個(gè)原則，我們規(guī)定四個(gè)環(huán)節(jié)，缺一不可：

第一步：績(jī)效計(jì)劃——設(shè)定績(jī)效目標(biāo)的溝通

實(shí)踐證明，目標(biāo)+溝通的績(jī)效管理方式最為有效和實(shí)用。只有目標(biāo)確立了，管理者才清楚怎么去進(jìn)行有效管理，員工才明白怎么做才是符合公司的要求與公司的發(fā)展相一致的。

績(jī)效管理是服務(wù)于公司戰(zhàn)略的，所以首先要明確公司的戰(zhàn)略目標(biāo)與任務(wù)是什么。這是管理者和員工對(duì)話的一個(gè)重要內(nèi)容，管理者必須和員工共同分享公司的目標(biāo)，然后將公司的目標(biāo)分解到部門，分解到員工。在充分溝通和協(xié)商的基礎(chǔ)上確立員工的績(jī)效目標(biāo)。具體地講，每個(gè)員工都應(yīng)該擁有一份個(gè)性化的關(guān)鍵績(jī)效目標(biāo)（KPI）。

確立績(jī)效目標(biāo)其實(shí)只有一句話：直接管理者需要下屬部門、員工做什么、改進(jìn)什么、朝那個(gè)方向努力，就將這些要求轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的指標(biāo)與目標(biāo)。同時(shí)要注意指標(biāo)不僅要關(guān)注結(jié)果(產(chǎn)出)，也關(guān)注流程(過程)，不僅關(guān)注收益增長(zhǎng)，也關(guān)注潛力增長(zhǎng)?？蓮囊韵聨讉€(gè)方面考慮KPI：

1、來源于職位應(yīng)承擔(dān)的責(zé)任

2、來源于部門總目標(biāo)，體現(xiàn)出該職位對(duì)總目標(biāo)的貢獻(xiàn)。

3、來源于業(yè)務(wù)流程最終目標(biāo)，體現(xiàn)出該職位對(duì)流程終