新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第二版)

94型冠狀病毒感染的肺炎試驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南〔其次版〕為指導(dǎo)各級(jí)疾控部門和其他相關(guān)機(jī)構(gòu)開(kāi)展型冠狀病毒感目前已經(jīng)比較成熟、易于實(shí)施的核酸檢測(cè)方法。一、標(biāo)本采集〔一聚攏性病例患者，其他需要進(jìn)展型冠狀病毒感染診斷或鑒別〔如溯源分析。(二)標(biāo)本采集要求。從事型冠狀病毒檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物〔培訓(xùn)合格護(hù)裝備〔personalprotectiveequipment，PPE〕要求：N95口體液、分泌物或排泄物時(shí)，戴雙層乳膠手套。住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。親熱接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。依據(jù)試驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，可結(jié)合病程屢次采樣?！踩總€(gè)病例必需采集急性期呼吸道標(biāo)本〔如支氣管或肺泡灌洗液等其他爭(zhēng)論材料依據(jù)設(shè)計(jì)需求采集。標(biāo)本種類：上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。下呼吸道標(biāo)本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本。7集量5ml，以空腹血為佳，建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液。清應(yīng)盡早〔最好在發(fā)病后7天內(nèi)〕釆集，其次份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，以空腹血為佳，建議使用真空釆血管?！菜摹硺?biāo)本采集方法。2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部3ml采樣液沖洗收集器1〔亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來(lái)替代收集器。3ml采樣液的50ml螺口塑料管中。支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入〔約30cm深處5ml頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次〔亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來(lái)替代收集。6．肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過(guò)口或鼻經(jīng)過(guò)咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管30~50ml，總量100~250ml，不應(yīng)超過(guò)300ml。血液標(biāo)本：建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2023rpm離心10集血漿和血液中細(xì)胞于無(wú)菌螺口塑料管中。血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2023rpm離心10分鐘，收集血清于無(wú)菌螺口塑料管中。其他材料：依據(jù)設(shè)計(jì)需求標(biāo)準(zhǔn)采集?！参鍢?biāo)本采集后在生物安全二級(jí)試驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝。全部標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍樣日期。將密閉后的標(biāo)本放入大小適宜的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標(biāo)本?！擦糜诓《痉謩e和核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)展檢測(cè)，能在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃保存；24小時(shí)內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存〔如無(wú)-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存。血清可在4℃存放3天，-20℃以下可長(zhǎng)期復(fù)凍融?！财唛L(zhǎng)途運(yùn)輸標(biāo)本，建議承受干冰等制冷方式進(jìn)展保藏。〔首例檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性、疑似聚攏性病例及聚攏性病例的標(biāo)本，上送中國(guó)疾病預(yù)防把握中心病毒病預(yù)防把握所進(jìn)展檢測(cè)復(fù)核，并附樣本送檢表〔見(jiàn)附件。病原體及標(biāo)本運(yùn)輸國(guó)內(nèi)運(yùn)輸型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運(yùn)輸包裝分類屬于A類，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN2814，包裝符合國(guó)際民航組織文件Doc9284PI602分類包裝要求；環(huán)境樣本屬于B類，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN3373，包裝符合國(guó)際民航組織文件Doc9284《危急品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的PI650分類包裝要求；通過(guò)其他交通工具運(yùn)輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料運(yùn)輸應(yīng)依據(jù)《可〔毒種或樣本運(yùn)輸治理規(guī)定》〔原衛(wèi)生部令第45號(hào)〕國(guó)際運(yùn)輸相關(guān)國(guó)家和國(guó)際相關(guān)要求。二、型冠狀病毒的試驗(yàn)室檢測(cè)RT-PCR鑒定。任何型冠狀病毒的檢測(cè)都必需在具備適當(dāng)條件的試驗(yàn)室由經(jīng)過(guò)相關(guān)技術(shù)安全培訓(xùn)的人員進(jìn)展操作。本指南中的核酸檢測(cè)方法主要針對(duì)型冠狀病毒基因組中開(kāi)放讀碼框1a/b〔openreadingframe1ab，ORF1ab〕〔nucleocapsidprotein，。在試驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)病例為陽(yáng)性，滿足以下條件：同一份標(biāo)本中型冠狀病毒2〔ORF1abN〕特異性實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。陰性結(jié)果也不能排解型冠狀病毒感染，需要排解可能產(chǎn)本；技術(shù)本身存在的緣由，如病毒變異、PCR抑制等。三、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)型冠狀病毒核酸〔一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)型冠狀病毒核酸的工作程序，保證明驗(yàn)結(jié)果的正確牢靠?！捕m用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)型冠狀病毒核酸?！踩陈氊?zé)。檢測(cè)人員：負(fù)責(zé)依據(jù)本檢測(cè)細(xì)則對(duì)被檢樣本進(jìn)展檢測(cè)。復(fù)核人員：負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)操作是否標(biāo)準(zhǔn)以及檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確進(jìn)展復(fù)核。部門負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對(duì)科室綜合治理和檢測(cè)報(bào)告的審核?！菜臉颖窘邮蘸皖A(yù)備。本應(yīng)存放于-70℃冰箱保存?！参濉硻z測(cè)工程。型冠狀病毒核酸測(cè)定〔實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法〕推舉選用針對(duì)型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區(qū)域的引物和探針。靶標(biāo)一〔ORF1ab：正向引物〔F：反向引物〔R：ACGATTGTGCATCAGCTGA熒光探針PHQ1-3”靶標(biāo)二〔N：正向引物〔F：反向引物〔R：熒光探針〔P：5”-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3”核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反響體系參考相關(guān)廠家試劑盒說(shuō)明。結(jié)果推斷陰性：無(wú)Ct值或Ct值>40。陽(yáng)性：Ct值<37，可報(bào)告為陽(yáng)性?？梢桑篊t值在37-40Ct值<40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本推斷為陽(yáng)性，否則為陰性。四、病原生物安全試驗(yàn)活動(dòng)要求危害程度分類中其次類病原微生物進(jìn)展治理，具體要求如下：〔一〕指病毒的分別、培育、滴定、中和試驗(yàn)、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組試驗(yàn)等操作。利用活病毒或其感染細(xì)胞〔或細(xì)胞提取物，不經(jīng)滅活進(jìn)展上述操作應(yīng)在具有開(kāi)展相應(yīng)活動(dòng)資質(zhì)的生物安全三級(jí)〔BiologicalSafetyLevel3,BSL-3〕試驗(yàn)室進(jìn)展。使用病毒培育物提取核酸時(shí)，裂解劑或滅活劑的參與必需在與病毒培育同等級(jí)別試驗(yàn)室和防護(hù)條件下進(jìn)展，牢靠方法滅活后的病毒培育物，可在BSL-2或BSL-1級(jí)試驗(yàn)室操作?！捕虚_(kāi)展相應(yīng)活動(dòng)資質(zhì)的動(dòng)物〔animal〕BSL-3〔ABSL-3〕試驗(yàn)室進(jìn)展操作。〔三未經(jīng)培育的感染性材料在承受牢靠的方法滅活前進(jìn)展的病毒抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、個(gè)人防護(hù)裝備參照生物安全三級(jí)試驗(yàn)室的防護(hù)要求。未經(jīng)牢靠滅活或固定的人和動(dòng)物組織標(biāo)本因含病毒量較高，其操作的防護(hù)級(jí)別應(yīng)比照病毒培育?！菜母腥拘圆牧匣蚧畈《驹诔惺芾慰康姆椒缁詈罂稍贐SL-1試驗(yàn)室操作?！参逯羔槍?duì)確認(rèn)無(wú)感染性的材料的各種操作，包括但不限于無(wú)感染性的病毒DNA或cDNA操作，應(yīng)在BSL-1試驗(yàn)室進(jìn)展。附件：型冠狀病毒檢測(cè)標(biāo)本送檢表附件型冠狀病毒檢測(cè)