乳及乳制品微生物檢測-克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的測定

克羅諾桿菌屬定性檢驗一二三四五六方法來源設(shè)備和材料培養(yǎng)基和試劑檢驗程序操作步驟

結(jié)果與報告一、方法來源此方法來源于國家標準GB4789.40-2016，該標準規(guī)定了食品中克羅諾桿菌屬(Cronobacter)的檢驗方法，適用于嬰幼兒配方食品、乳和乳制品及其原料中克羅諾桿菌屬的檢驗。二、設(shè)備和材料1.恒溫培養(yǎng)箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃。2.冰箱：2℃~5℃。3.恒溫水浴箱：44℃±0.5℃。4.天平：感量0.1g。5.均質(zhì)器。拍打式均質(zhì)器二、設(shè)備和材料6.振蕩器。7.無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。8.無菌錐形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。9.無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。10.pH計或pH比色管或精密pH試紙。11.全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。振蕩器三、培養(yǎng)基和試劑1.緩沖蛋白胨水(bufferpeptonewater，BPW)2.改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm)3.克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）顯色培養(yǎng)基。4.胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticasesoyagar，TSA)5.克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）生化鑒定試劑盒。北京陸橋ESM008A阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基

三、培養(yǎng)基和試劑6.氧化酶試劑7.L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基8.L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基9.L-精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基10.糖類發(fā)酵培養(yǎng)基11.西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基北京陸橋阪崎腸桿菌干制生化鑒定試劑盒四、檢驗程序圖25.6克羅諾桿菌屬檢驗程序五、操作步驟（一）前增菌（二）選擇性增菌（三）平板分離（四）平板確認（五）生化鑒定注意：克羅諾桿菌屬為致病菌，以下操作請在生物安全柜中進行。五、操作步驟取檢樣100g(mL)置滅菌錐形瓶中，加入900mL已預(yù)熱至44℃的緩沖蛋白胨水，用手緩緩地搖動至充分溶解，36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。使用的增菌液為緩沖蛋白胨水（BPW），它營養(yǎng)豐富，有利于培養(yǎng)環(huán)境形成緩沖體系。（一）前增菌圖25.7100g樣品加900mL增菌液未混勻狀態(tài)（左）和混勻狀態(tài)（右）五、操作步驟移取1mL轉(zhuǎn)種于10mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。選擇性增菌液使用的是改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨加萬古霉素增菌液(mLST-Vm)。改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨含鹽量高，有利于篩選耐高滲透壓的克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），因前增菌已經(jīng)優(yōu)化，僅使用1mL前增菌液即可。萬古霉素能有效抑制革蘭氏陽性菌（G+）生長，較高溫度培養(yǎng)可以抑制其他細菌生長，而克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）能在高溫下生長更好。注意改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLST-Vm）滅菌后使用前再加萬古霉素，放置時間不超過24h。要求44℃培養(yǎng)，溫度波動＜0.5℃。（二）選擇性增菌五、操作步驟輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，各取增菌培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，顯色培養(yǎng)基須符合GB4789.28的要求，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，或按培養(yǎng)基要求條件培養(yǎng)。一種顯色培養(yǎng)基為添加5-溴-4-氯-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷(XαGLC)的胰蛋白胨瓊脂（TSA），克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）產(chǎn)生的特異性α-葡萄糖苷酶可以分解底物形成藍綠色菌落，選擇性極佳。在添加4-甲基傘形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(Na+α-MUG)的培養(yǎng)基上可產(chǎn)生熒光菌落，也可作為克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）選擇性培養(yǎng)基使用。（三）平板分離圖25.8選擇性培養(yǎng)基上的疑似克羅諾菌屬菌落五、操作步驟挑取至少5個可疑菌落，不足5個時挑取全部可疑菌落，劃線接種于TSA平板。25℃±1℃培養(yǎng)48h±4h。在TSA培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃色色素的為高度疑似菌落。（四）平板確認圖25.9胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）上的平板確認五、操作步驟自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，進行生化鑒定。克羅諾桿菌屬的主要生化特征見表25.2?？蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)，操作方法見項目25技能點2。（五）生化鑒定生化實驗特征黃色素產(chǎn)生+氧化酶-L-賴氨酸脫羧酶-L-鳥氨酸脫羧酶(+)L-精氨酸雙水解酶+檸檬酸水解(+)發(fā)酵D-山梨醇(-)L-鼠李糖+D-蔗糖+D-蜜二糖+苦杏仁甙+注：+＞99%陽性；-＜99%陰性；(+)90%～99%陽性；(-)90%～99%陰性。表25.2克羅諾桿菌屬的主要生化特征六、結(jié)果與報告綜合菌落形態(tài)和生化特征，報告每100g(mL)樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬?？肆_諾桿菌屬的計數(shù)一二三四方法來源

設(shè)備和材料培養(yǎng)基和試劑操作步驟一、方法來源此方法來源于國家標準GB4789.40-2016，該標準規(guī)定了食品中克羅諾桿菌屬(Cronobacter)的檢驗方法，適用于嬰幼兒配方食品、乳和乳制品及其原料中克羅諾桿菌屬的檢驗。二、設(shè)備和材料1.恒溫培養(yǎng)箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃。2.冰箱：2℃～5℃。3.恒溫水浴箱：44℃±0.5℃。4.天平：感量0.1g。5.均質(zhì)器。6.振蕩器。無菌均質(zhì)器二、設(shè)備和材料7.無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。8.無菌錐形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。9.無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。10.pH計或pH比色管或精密pH試紙。11.全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。全自動微生物生化檢定系統(tǒng)三、培養(yǎng)基和試劑1.緩沖蛋白胨水(bufferpeptonewater，BPW)2.改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm)3.克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）顯色培養(yǎng)基。4.胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticasesoyagar，TSA)5.克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）生化鑒定試劑盒。6.氧化酶試劑三、培養(yǎng)基和試劑7.L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基8.L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基9.L-精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基10.糖類發(fā)酵培養(yǎng)基11.西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基四、操作步驟（一）樣品的稀釋（二）分離、鑒定（三）結(jié)果與報告注意：克羅諾桿菌屬為致病菌，以下操作請在生物安全柜中進行。四、操作步驟1.固體和半固體樣品無菌稱取樣品100g、10g、1g各三份，分別加入900mL、90mL、9mL已預(yù)熱至44℃的BPW，輕輕振搖使充分溶解，制成1∶10樣品勻液，置36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。分別移取1mL轉(zhuǎn)種于10mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。（一）樣品的稀釋四、操作步驟2.液體樣品以無菌吸管分別取樣品100mL、10mL、1mL各三份，分別加入900mL、90mL、9mL已預(yù)熱至44℃的BPW，輕輕振搖使充分混勻，制成1∶10樣品勻液，置36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。分別移取1mL轉(zhuǎn)種于10mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。（一）樣品的稀釋四、操作步驟具體內(nèi)容見項目25技能點1和項目25技能點2。（二）分離、鑒定分離培養(yǎng)基上的克羅諾桿菌屬四、操作步驟綜合菌落形態(tài)、生化特征，根據(jù)證實為克羅諾桿菌屬的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100g(mL)樣品中克羅諾桿菌屬的MPN值(見表25.3)。（三）結(jié)果與報告陽性管數(shù)MPN95%可信限陽性管數(shù)MPN95%可信限100101下限上限100101下限上限000＜0.3-0.952202.10.454.20010.30.0150.962212.80.879.40100.30.0151.12223.50.879.40110.610.121.82302.90.879.40200.620.121.82313.60.879.40300.940.363.83002.30.469.41000.360.0171.83013.80.87111010.720.131.83026.41.7181021.10.363.83104.30.918表25.3克羅諾桿菌屬的MPN值1100.740.1323117.51.7201111.10.363.8312123.7421201.10.364.2313164421211.50.454.23209.31.8421301.60.454.2321153.7422000.920.143.8322214432011.40.364.232329910020220.454.2330244.21002101.50.374.233146920021120.454.2332110184102122.70.879.4333＞11042-注1：本表采用3個檢樣量[100g(mL)、10g(mL)和1g(mL)]，每個檢樣量接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1000g(mL)、100g(mL)和10g(mL)時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用10g(mL)、1g(mL)和0.1g(mL)時，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。克羅諾桿菌屬

檢測意義、原理及方法一二三克羅諾桿菌屬的檢測意義克羅諾桿菌屬的檢測原理克羅諾桿菌屬的檢測方法一、檢測意義（一）克羅諾桿菌屬概述（二）克羅諾桿菌屬分布（三）克羅諾桿菌屬致病性和致病物質(zhì)（四）克羅諾桿菌屬的治療和控制預(yù)防一、克羅諾桿菌屬的檢測意義1961年英國Franklin等首次報道了2例產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌致新生兒腦膜炎以后，相繼在世界范圍內(nèi)(美國、冰島、荷蘭等國家)報道了一系列新生兒產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌感染事件。1980年Farmer等在文獻中指出通過DNA雜交他們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌之間DNA一致性可達83%～89%，而產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌與陰溝腸桿菌的DNA共有序列只有31%～49%，建議對產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌重新分類。最終產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌被認為是一個新的菌種，并以日本微生物學(xué)家——RiichiSakazakii的名字命名，即阪崎腸桿菌（Enterobactersakazakii）。（一）概述一、克羅諾桿菌屬的檢測意義2004年2月WHO/FAO就嬰兒配方奶粉含阪崎腸桿菌課題召開專家會議，做了初步的危險評估，將阪崎腸桿菌列為嬰兒配方奶粉中的A類致病菌。2004年3月，國際食品法典委員會（CAC）的食品衛(wèi)生委員會（CCFH）同意盡快修訂嬰幼兒食品衛(wèi)生操作國際標準，包括阪崎腸桿菌及相關(guān)微生物的微生物學(xué)標準。（一）概述一、克羅諾桿菌屬的檢測意義最近幾年的研究結(jié)果建議對阪崎腸桿菌進行新的分類，在阪崎腸桿菌的分類關(guān)系發(fā)生變化之后，由一個種成為一個新屬，即克羅諾桿菌屬(Cronobacterspp.)，該屬包括6個種和3個亞種，這6個種分別是阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)、蘇黎世克羅諾桿菌(Cronobacterturicensis)、都柏林克羅諾桿菌(Cronobacterdublinensis)、穆汀斯克羅諾桿菌(Cronobactermuytjensii)、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌(Cronobactermalonaticus)、克羅諾桿菌基因種1(Cronobactergenomospecies1)。（一）概述一、克羅諾桿菌屬的檢測意義嬰兒配方粉在制造過程中要經(jīng)過巴斯德消毒，克羅諾桿菌經(jīng)過這樣的處理后不可能繼續(xù)存活。因此，終產(chǎn)品中克羅諾桿菌的污染很可能是來自廠房環(huán)境、巴斯德消毒后添加熱敏感性微量元素的過程或配方粉的沖調(diào)期。1.環(huán)境2003年Hamilton等從廄螫蠅（Stomoxyscalcitrans，圖25.1）腸中分離到克羅諾桿菌，據(jù)此認為廄螫蠅幼蟲腸道是克羅諾桿菌的環(huán)境宿主之一。（二）分布圖25.1廄螫蠅（Stomoxyscalcitrans）——克羅諾桿菌的環(huán)境宿主之一一、克羅諾桿菌屬的檢測意義2.食品及相關(guān)用品在設(shè)計預(yù)防新生兒克羅諾桿菌感染措施時，應(yīng)該考慮到克羅諾桿菌環(huán)境分布的廣泛性。值得一提的是與嬰幼兒密切相關(guān)的食物和用具，例如嬰兒配方奶粉、普通奶粉、豆粉、碎牛肉、肉類、香腸、發(fā)酵面包、豆腐、蔬菜、水（水管道、水過濾膜）、調(diào)味品、干酪、嬰兒配方粉沖調(diào)用具（攪拌器、勺子、甁刷）等的衛(wèi)生狀況尤為值得關(guān)注。（二）分布圖25.2阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）DNA“指紋圖譜”比對，發(fā)現(xiàn)問題食品示意圖一、克羅諾桿菌屬的檢測意義3.嬰幼兒配方乳粉的污染Breeu.Wer等研究發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌并非具有特殊的耐熱性，但能耐受一定程度的滲透壓和干燥。研究結(jié)果證明，克羅諾桿菌的耐熱性不足以使該菌經(jīng)標準的巴斯德消毒后幸存，產(chǎn)品的污染很可能發(fā)生在干燥和罐裝階段。與大腸埃希菌、沙門氏菌相比，克羅諾桿菌對滲透壓和干燥具有更高的耐受力，這很可能與細胞內(nèi)大量的海藻糖酶導(dǎo)致細胞內(nèi)累計大量海藻糖有關(guān)。（二）分布圖25.3克羅諾桿菌屬的污染途徑一、克羅諾桿菌屬的檢測意義1.致病性克羅諾桿菌屬感染的大多數(shù)病例都是嬰兒，特別是早產(chǎn)兒、出生體重偏低等身體狀況較差的新生兒。感染主要引起腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎，該菌偶爾還可引起成人局部感染和菌血癥等。（三）致病性和致病物質(zhì)一、克羅諾桿菌屬的檢測意義1）嬰幼兒腦膜炎未足月出生的新生兒占75%。主要表現(xiàn)為發(fā)熱，面色蒼白，有抽搐或顫抖，張力亢進，囟門隆出，無頸項強直。合并有菌血癥者占5/8，壞死性小腸結(jié)腸炎占2/8，死亡率高達75%。克羅諾桿菌引起的腦膜炎常引起腦梗塞、腦膿腫、囊腫形成和腦室炎等并發(fā)癥，并且可引起神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥或迅速死亡。（三）致病性和致病物質(zhì)一、克羅諾桿菌屬的檢測意義2）新生兒菌血癥寒戰(zhàn)，白細胞偏低，血液培養(yǎng)分離可得到克羅諾桿菌，多數(shù)癥狀較輕，如出現(xiàn)嚴重的膿毒血癥，死亡率可達36%3）新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎多發(fā)生于未足月出生體重較輕的嬰幼兒。4）成人感染克羅諾桿菌引起成人菌血癥或局部感染。（三）致病性和致病物質(zhì)一、克羅諾桿菌屬的檢測意義2.致病物質(zhì)Pagotto等在2003年首次描述了某些阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）可能產(chǎn)生一種毒力因子——類腸毒素樣化合物。組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)一些菌株可產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)。Townsend等發(fā)現(xiàn)嬰兒配方奶粉中含有細菌脂多糖——內(nèi)毒素（LPS），具有熱穩(wěn)定性，能增加小腸上皮細胞通透性，促使細菌侵入腸壁中而致病。Mange等通過體外組織細胞培養(yǎng)實驗觀察到克羅諾桿菌對人類上皮細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞有吸附粘連特性，并形成叢生，表面形成生物保護膜。（三）致病性和致病物質(zhì)一、克羅諾桿菌屬的檢測意義1.治療克羅諾桿菌屬對先鋒霉素Ⅰ和新諾明之外的所有試驗用藥敏感，且對氨比西林敏感。雖然克羅諾桿菌屬的最佳抗生素治療方法尚未確定，但在大數(shù)早期報告的病例中都是應(yīng)用氨比西林和慶大霉素聯(lián)合療法。（四）治療和控制預(yù)防一、克羅諾桿菌屬的檢測意義2.控制預(yù)防1）制定相應(yīng)管理辦法2）加強技術(shù)研究3）對特定消費群體加大宣傳力度對嬰幼兒奶粉消費者群體進行克羅諾桿菌屬致病性和預(yù)防措施的宣傳，尤其強調(diào)用商業(yè)無菌液體或開水沖調(diào)配方食品，喂養(yǎng)嬰幼兒后剩余的調(diào)配食品應(yīng)放置冰箱保存，并在食用前再加熱。（四）克羅諾桿菌屬的治療和控制預(yù)防二、檢測原理（一）克羅諾桿菌屬形態(tài)（二）克羅諾桿菌屬的生理、生化反應(yīng)（三）克羅諾桿菌屬的生態(tài)特性（四）克羅諾桿菌屬的增殖能力二、克羅諾桿菌屬的檢測原理1.個體形態(tài)和染色反應(yīng)克羅諾桿菌屬為革蘭氏陰性（G-，圖25.4）無芽孢桿菌、周身菌毛，有鞭毛，有動力，大多數(shù)產(chǎn)黃色素。2.群體（菌落）形態(tài)在添加5-溴-4-氯-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷(XαGLC)的胰蛋白胨瓊脂（TSA）上，因克羅諾菌屬有α-葡萄糖苷酶活性，分解底物形成藍綠色菌落，選擇性極佳（圖25.5），它現(xiàn)已作為克羅諾桿菌屬的選擇性培養(yǎng)基。（一）形態(tài)圖25.4顯微鏡下克羅諾桿菌屬革蘭氏染色圖圖25.5添加XαGLC的TSA培養(yǎng)基上克羅諾桿菌屬菌落二、克羅諾桿菌屬的檢測原理1.營養(yǎng)需求克羅諾桿菌屬營養(yǎng)要求不高，能在胰蛋白胨瓊脂(TSA)、腦心浸液瓊脂(BHI)、血平板、麥康凱(Mac

Conkey，MAC)瓊脂、伊紅美藍瓊脂、脫氧膽酸瓊脂等多種培養(yǎng)基上生長繁殖。2.酶和代謝產(chǎn)物克羅諾桿菌屬產(chǎn)酶種類和反應(yīng)特性，代謝產(chǎn)物的種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)等生化特征見表25.1。（二）生理、生化反應(yīng)生化實驗特征黃色素產(chǎn)生+氧化酶-L-賴氨