免疫學(xué)檢測(cè)原理防治

1免疫學(xué)檢測(cè)原理和免疫學(xué)防治王平章2015年6月12日2教學(xué)要求掌握抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)掌握ELISA的基本原理熟悉檢測(cè)體液免疫和細(xì)胞免疫的常用方法了解免疫學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用熟悉疫苗的種類(lèi)及發(fā)展方向了解免疫學(xué)防治的措施3第二十二章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)4免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)習(xí)慣上，將利用未做修飾的抗原、抗體以及補(bǔ)體進(jìn)行的相關(guān)檢測(cè)方法，稱為經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)，如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)等血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)將利用各種標(biāo)記的抗原或抗體、以及利用輔助工具如流式細(xì)胞術(shù)開(kāi)展的檢測(cè)技術(shù),免疫細(xì)胞技術(shù)等，習(xí)慣上歸屬為現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)5免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)抗原抗體反應(yīng)的原理,特點(diǎn)及影響因素常見(jiàn)的檢測(cè)抗原或抗體的體外試驗(yàn)免疫細(xì)胞功能檢測(cè)6第一節(jié)體外抗原抗體反應(yīng)（血清學(xué)反應(yīng)）7

抗原抗體反應(yīng)的原理抗原的抗原決定基與抗體的結(jié)合部位之間的結(jié)構(gòu)具有互補(bǔ)性，二者相互結(jié)合后，在適宜的條件下，可出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。

Ag2

Ag1Ab8抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)高度特異性可逆性依賴一定的抗原、抗體濃度及比例抗原抗體反應(yīng)呈現(xiàn)的兩個(gè)階段91、高度特異性指一種抗原只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合的專一性。特異性由抗原表位與抗體的CDR(complementarity-determiningregion)互補(bǔ)結(jié)合所決定。

Ab10人血清中的抗體是具有多樣性思考：Ig多樣性的分子機(jī)制？11抗體的特異性是免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)各種檢測(cè)Westernblotting

ImmunofluorescenceELISAELISPOTProteinmicroarray診斷,預(yù)防,治療122、抗原抗體反應(yīng)的可逆性抗原抗體的結(jié)合主要是分子表面的非共價(jià)結(jié)合，穩(wěn)定，但在適當(dāng)條件下可以解離，各自生物學(xué)特點(diǎn)不變。13抗體純化、免疫親和層析AgarosebeadsAgarosebeads14免疫(共)沉淀AgarosebeadsAg/Bait免疫沉淀-Immunoprecipitation(IP)免疫共沉淀-Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Prey目的抗原蛋白質(zhì)復(fù)合物15magneticparticles/beadsCD19Bcell磁珠分選細(xì)胞16AbexcessAgexcess3、適宜的抗原抗體濃度和比例Equivalence–Latticeformation抗原、抗體在一定濃度和比例時(shí)可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)物（凝集物或沉淀物）；比例合適、顆粒性抗原，或IgM易形成大分子IC。實(shí)踐中，需要調(diào)整兩者的比例，如倍比稀釋的方式，避免假陰性。思考：中等大小IC的病理意義？174、抗原抗體反應(yīng)的兩個(gè)階段特異性結(jié)合階段迅速，數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)完成，一般無(wú)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)(肉眼)可見(jiàn)反應(yīng)階段IC之間靠電荷作用聚集，數(shù)分鐘-數(shù)天不等。思考：現(xiàn)代免疫檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)？18請(qǐng)勿超過(guò)MAX線MAX線陽(yáng)性無(wú)效陰性膠體金免疫層析法（膠體金標(biāo)記技術(shù)+免疫層析）19Anti-HCG(Ab1)膠體金標(biāo)記CTHCGAnti-HCG(Ab2)Anti-Ab1(Ab3)20抗原抗體反應(yīng)的影響因素1、電解質(zhì)2、溫度:37℃3、酸堿度:pH6-8之間21第二節(jié)檢測(cè)抗原和抗體的體外試驗(yàn)22檢測(cè)抗原或抗體的方法傳統(tǒng)血清學(xué)反應(yīng)直接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)單向瓊脂擴(kuò)散雙向瓊脂擴(kuò)散免疫標(biāo)記技術(shù)免疫酶測(cè)定法免疫熒光技術(shù)放射免疫測(cè)定法免疫印跡技術(shù)，等經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)23凝集反應(yīng)(agglutinationreaction)24直接凝集反應(yīng)++++++++++-ABO血型鑒定菌種鑒定、血清型鑒定25葡萄球菌乳膠凝集試劑盒D群鏈球菌乳膠凝集試劑盒大腸桿菌O157乳膠凝集試劑盒鏈球菌乳膠凝集試劑盒李斯特氏菌乳膠凝集試劑盒艱難梭狀芽孢桿菌乳膠凝集試劑盒彎曲桿菌乳膠凝集試劑盒金黃色葡萄球菌乳膠凝集試劑盒間接凝集反應(yīng)(反向)聚苯乙烯乳膠顆粒26可溶性抗原，液體或半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行在液體中形成沉淀環(huán)和絮狀沉淀凝膠中沉淀反應(yīng)單向瓊脂擴(kuò)散雙向瓊脂擴(kuò)散免疫電泳沉淀反應(yīng)(precipitationreaction)27免疫標(biāo)記技術(shù)

(immunolabelingtechnique)用放射性核素、酶、熒光素等示蹤劑標(biāo)記抗原或抗體后進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)靈敏度高、快速；可用于定性、定量、定位分析等。改變的是抗原抗體反應(yīng)的可見(jiàn)方式，并不改變反應(yīng)的本質(zhì)及特點(diǎn)28免疫酶測(cè)定法

(enzymeimmunoassay,EIA)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性+酶對(duì)底物的高效催化作用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)EmzymeLinkedImmunoSorbentAssay,ELISA29酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，常用于測(cè)定可溶性抗原或抗體，如檢測(cè)血清、胸水、腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。酶標(biāo)記抗原或抗體1酶分解底物產(chǎn)生有色物質(zhì)2酶標(biāo)儀對(duì)有色物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定3通過(guò)光密度值（OD）評(píng)價(jià)抗體或抗原含量430

DirectELISA

IndirectELISASandwichELISA

CompetitiveELISA待檢抗體待檢抗原已知抗原已知抗體31思考：幾個(gè)抗原抗體反應(yīng)？32BAS-ELISA：生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)ELISA的放大系統(tǒng)33免疫組化技術(shù)

(immunohistochemistrytechnique)利用標(biāo)記的特異性抗體在組織/細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)抗原進(jìn)行定位、定性和定量檢測(cè)的技術(shù)。可在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)。

標(biāo)記物：酶（如HRP,AP）、熒光素、膠體金等組織標(biāo)本：石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片細(xì)胞標(biāo)本：細(xì)胞爬片，細(xì)胞涂片，組織印片。34×200×200×400×400食管鱗狀細(xì)胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma)結(jié)腸腺癌(colonadenocarcinoma)35胃底腺黏膜36放射免疫測(cè)定

(radioimmunoassay,RIA)利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原，同抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)的方法敏感度pg水平,常用于檢測(cè)微量物質(zhì)胰島素,生長(zhǎng)激素,甲狀腺素,嗎啡,地高辛藥物和IgE等.美國(guó)科學(xué)家耶洛(RosalynYalow)采用131I標(biāo)記的胰島素作為失蹤劑，利用胰島素與其特異性抗體之間的反應(yīng)，建立了胰島素的放射免疫測(cè)定法，而獲得1977年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。37免疫熒光技術(shù)

(immunofluorescencetechnique)某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光照下，可發(fā)出波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)長(zhǎng)的光線-即熒光。這些受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光素?？蓸?biāo)記抗原或抗體。38異硫氰酸熒光素藻紅蛋白39可以用于檢查細(xì)菌、病毒、螺旋體等抗原、抗體，幫助診斷傳染病；也可以鑒定細(xì)胞表面的CD分子，檢測(cè)AID的抗核抗體等。4041免疫印跡技術(shù)(immunoblotting,Westernblotting)將十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)分離得到的按分子量排列的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體膜上，再利用標(biāo)記（如酶、放射性核素、熒光素）的特異性抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的技術(shù)。廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。4243體內(nèi)示蹤44第三節(jié)免疫細(xì)胞功能的檢測(cè)45T細(xì)胞功能B細(xì)胞功能CTL、NK細(xì)胞功能吞噬細(xì)胞功能免疫細(xì)胞的分離細(xì)胞因子測(cè)定46免疫細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)PBMC=lymphocyte+monocyte+DC47密度梯度離心-isolationofPBMC1.077g/ml離心后各細(xì)胞沉降于密度梯度液中與自身密度相同的密度平衡點(diǎn)1.075g/ml48免疫吸附法：抗體包被于聚苯乙烯培養(yǎng)板,加入淋巴細(xì)胞懸液，表達(dá)相應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)志的淋巴細(xì)胞被貼附在培養(yǎng)板上，從而與其他細(xì)胞分開(kāi)。免疫磁珠法(immunemagneticbead,IMB)：抗體與磁珠交聯(lián);magnetic-activatedcellsorting,MACS.熒光激活細(xì)胞分離儀分離法/流式細(xì)胞術(shù)分離法（fluorescenceactivatedcellsorting,FACS）（flowcytometry,FCM）抗原特異性的CTL：抗原肽－MHC分子四聚體技術(shù)

淋巴細(xì)胞及其亞群的分離49免疫磁珠分離法antibodycoatedmagneticbeadsantigenpositivecellscellsuspensionantigennegativecellsdissociatingagentantigenpositivecellsseparatecellsinamagneticfield50流式細(xì)胞術(shù)(FACS/FCM)細(xì)胞被熒光標(biāo)記

(Ab，熒光蛋白）單細(xì)胞排列被快速噴出細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生散射光判定細(xì)胞是否需要分選細(xì)胞被賦予不同的電荷可同時(shí)測(cè)定多項(xiàng)參數(shù)可多色熒光組合使用(被熒光標(biāo)記的單細(xì)胞懸液）5152流式細(xì)胞術(shù)操作流程樣本收集及處理制備單細(xì)胞懸液免疫熒光染色上機(jī)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析53流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度DNA含量RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞表面積核漿比例

……特異性抗原、受體細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的修飾增殖/凋亡/存活狀態(tài)pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位

……細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞功能54SpleenThymus55抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)四聚體技術(shù)即MHC-I類(lèi)分子-肽四聚體復(fù)合物標(biāo)記CTL的流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)56免疫細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞功能測(cè)定B細(xì)胞功能測(cè)定CTL,NK細(xì)胞功能測(cè)定吞噬細(xì)胞功能測(cè)定57T細(xì)胞增殖試驗(yàn)形態(tài)計(jì)數(shù)法

增殖時(shí)體積增大，形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)增多，核松散，較多核仁3H標(biāo)記的胸腺嘧啶（3H-TdR）摻入法/125I-UdR摻入法MTT法58MTT法3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽甲瓚淡黃色，可溶性藍(lán)紫色，不溶性59遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)

(delayed-typehypersensitivity,DTH)體內(nèi)檢測(cè)，細(xì)胞免疫功能皮試常用的生物性抗原：結(jié)核菌素、念珠菌素、麻風(fēng)菌素、鏈激酶-鏈道酶和腮腺炎病毒等。原理:

遲發(fā)型超敏反應(yīng)/Ⅳ型超敏反應(yīng)，產(chǎn)生以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和局部組織細(xì)胞損傷為主的炎癥。陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強(qiáng)烈的可發(fā)生水腫，甚至壞死。60結(jié)核菌素試驗(yàn)

(包括OT-test和PPD-test兩種試驗(yàn))OT試驗(yàn)：舊結(jié)核菌素（結(jié)核桿菌培養(yǎng)液濃縮后的粗制品）PPD試驗(yàn)：純蛋白衍化物（結(jié)核桿菌培養(yǎng)物的純化制品）皮試48～72小時(shí)有紅腫硬結(jié)>5毫米為陽(yáng)性，否則為陰性正常人為弱陽(yáng)性，即硬結(jié)直徑為5～9mm20mm以上或局部皮膚發(fā)生水泡與壞死者為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，提示可能有活動(dòng)性感染61B細(xì)胞功能測(cè)定單向瓊脂擴(kuò)散法、ELISA、速率比濁法等測(cè)定標(biāo)本中IgG、IgA、IgM等各類(lèi)Ig的含量?？贵w形成細(xì)胞測(cè)定：常用溶血空斑試驗(yàn)檢測(cè)（plaqueformingcelltest,PFCtest）脾臟細(xì)胞懸液+綿羊紅細(xì)胞(SRBC)+補(bǔ)體62細(xì)胞毒試驗(yàn)（殺傷細(xì)胞活性檢測(cè)）檢測(cè)CTL、NK等細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞活性的技術(shù)，主要用于腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)和病毒感染等方面的研究CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：常采用51Cr釋放法NK細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)：常用的靶細(xì)胞為K56263殺傷試驗(yàn)：Cr釋放法64凋亡細(xì)胞檢測(cè)法形態(tài)學(xué)檢測(cè)FACS(FITC-AnnexinV選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸)梯狀凝膠電泳TUNEL法（DNA斷裂缺口中的3’-OH的原位標(biāo)記）凋亡信號(hào)通路的活化狀態(tài)Westernblot檢測(cè)靶分子切割…晚期早期HeLaDNA電泳PS外翻65吞噬功能測(cè)定將吞噬細(xì)胞與某種可被吞噬又易于計(jì)數(shù)的顆粒性物質(zhì)混合溫育后，顆粒物質(zhì)被吞噬細(xì)胞吞噬，根據(jù)吞噬百分率即可反映吞噬細(xì)胞的吞噬能力。巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)酵母聚糖(zymosan)吞噬試驗(yàn)zymosanphagocytosisbyhumanneutrophils66細(xì)胞因子的檢測(cè)（1）生物活性檢測(cè)法根據(jù)不同的細(xì)胞因子具有的不同的生物學(xué)活性，可采取相應(yīng)的測(cè)定方法。①細(xì)胞增殖或抑制法：CTLL-2依賴IL-2；IL-1對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A352具有抑制作用②細(xì)胞病變抑制法：干擾素抑制病毒感染細(xì)胞67（2）免疫學(xué)檢測(cè)法①幾乎所有的細(xì)胞因子都可以用ELISA（如雙抗體夾心法）進(jìn)行檢測(cè)。②胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)法（通常要用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑處理，如BFA）③酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunospot,ELISPOT）產(chǎn)生細(xì)胞因子或抗原特異性的抗體分泌細(xì)胞的細(xì)胞頻數(shù)檢測(cè)68ELISPOT69計(jì)算斑點(diǎn)70第二十三章免疫學(xué)防治71疫苗的使用與疾病控制其他傳染病：鼠疫、霍亂、梅毒、瘧疾、狂犬病、肺結(jié)核…72許多疾病無(wú)有效疫苗病毒：HIV，皰疹病毒細(xì)菌：葡萄球菌，A組鏈球菌真菌：假絲酵母原生動(dòng)物：瘧疾，利什曼病蠕蟲(chóng)感染：血吸蟲(chóng)病…皮膚暗絲孢霉菌(phaeohyphomycosis)73疫苗開(kāi)發(fā)策略的轉(zhuǎn)變反向/逆向疫苗策略

(reversevaccinology)74滅活疫苗（死疫苗）減毒活疫苗類(lèi)毒素疫苗亞單位疫苗結(jié)合疫苗聯(lián)合疫苗重組載體疫苗DNA疫苗合成肽疫苗食用疫苗…現(xiàn)代疫苗種類(lèi)